響應曲面法優化文冠果種仁蛋白的堿溶酸沉提取工藝

鄧 紅，田蕓蕓，田子卿，仇農學，郭玉蓉

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062)

響應曲面法優化文冠果種仁蛋白的堿溶酸沉提取工藝

鄧 紅，田蕓蕓，田子卿，仇農學，郭玉蓉

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062)

以文冠果種仁脫脂粉為原料，采用堿溶酸沉法提取文冠果蛋白，利用響應曲面法優化其提取工藝。運用Box－Behnken實驗設計方法，在單因素實驗的基礎上，以蛋白質得率為實驗指標，研究液料比、pH、提取時間以及提取溫度等影響因素及其交互作用對蛋白質得率的影響。實驗結果表明，文冠果蛋白質堿溶酸沉的最佳提取工藝參數為:液料比11∶1(mL/g)，pH11，提取時間73min，提取溫度41℃。在本實驗范圍內各影響因素對蛋白質提取率作用的大小依次為:pH＞液料比＞時間＞溫度。在此條件下，蛋白質提取率達到83.58%，利用響應面分析法得到的二次多項式回歸方程數學模型Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C+5.11BC－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2能較準確地預測實驗結果。

文冠果，蛋白質，提取

Abstract:The Xanthoceras sorbifolia bunge kernel protein was extracted by Alkali－Solution and Acid－Isolation.The extraction processing was optimized through response surface analysis.By use of the Box－Behnken experimental design method，the effects of the ratio of liquid，pH，extraction time and temperature and their interactions on the protein yield were studied on the base of the single－factor test.The test results showed that the optimum conditions of alkali－solution and acid－isolation extraction for Xanthoceras sorbifolia bunge protein were as following:the ratio of liquid 11∶1(mL/g)，pH11，extraction time 73min，extraction temperature 41℃.The influence order of factors to protein extracting rate is pH＞ratio between solid and liquid＞reaction time＞reaction temperature.Under these conditions，the rate of protein extraction reached 83.58%.The mathematic model of the quadratic polynomial regression equation was obtained through the method of response surface analysis which could predict the yield of protein exactly.

Key words:Xanthoceras sorbiflia bunge;protein;extraction

文冠果(Xanthoceras sorbifoLia Bunge)為無患子科文冠果屬落葉喬木或大灌木，是中國特有的珍稀木本油料樹種，也是中國北方地區很有發展前途的水土保持樹種和珍稀觀賞樹木［1－3］。文冠果種仁既含有大量的油脂，又含有豐富的植物蛋白質，據分析其種仁含油脂58.91%，有14種脂肪酸，不飽和脂肪酸含量高達94%;種仁含蛋白25.75%，有17種氨基酸，必需氨基酸種類齊全，且氨基酸評分較高，具有很高的營養價值［4－6］。蛋白質由于種類多、性質差異大，因而提取與制備方法也很多。由于大部分蛋白質均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數與脂類結合的蛋白質溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中，所以可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質。目前，油料蛋白質的提取主要有反膠束溶液萃取、等電點沉淀、離子交換、堿溶酸沉、膜分離等方法［7－9］，其中堿溶酸沉法是我國普遍采用的生產工藝，此法能夠有效地提高產品得率，充分利用蛋白資源。目前關于文冠果種仁蛋白提取的報道較少，本實驗以文冠果種仁脫脂粉為原料，采用響應面分析法優化文冠果蛋白質堿溶酸沉的工藝條件，探討液料比、pH、時間和溫度等因素對文冠果蛋白質得率的影響，確定最佳工藝參數，為深入開發利用文冠果蛋白質資源提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

文冠果籽 購于陜西志丹，挑選完整、飽滿、無蟲害的文冠果籽作為實驗原料，手工去殼，種仁粉碎，過40目后冷榨取油，渣餅脫脂后粉碎冷藏備用。95%乙醇 分析純，西安三浦精細化工廠;氫氧化鈉

分析純，天津市化學試劑三廠;石油醚 30～60℃，分析純，天津市富宇精細化工有限公司;無水硫酸鈉、氫氧化鉀 分析純，天津市河東區紅巖試劑廠;鹽酸 分析純，天津市津北精細化工有限公司;酚酞

分析純，天津市富宇精細化工有限公司。

KDY－9810型凱氏定氮儀 北京市通潤機電有限公司;121MB型氨基酸自動分析儀 美國貝克曼(Beckman)公司;超速粉碎機 天津市達康電器公司;真空冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;PHS－3C精密pH計、JA2003N型電子天平 上海精密科學儀器有限公司;DF－101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠;722型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 文冠果蛋白的制備

1.2.1.1 原料預處理 將文冠果仁渣餅粉碎，45℃下用石油醚(30～60℃)脫脂四次，置通風廚中12h以揮發溶劑，得脫脂粉，于冰箱4℃保存備用。脫脂文冠果粉中蛋白質含量測定采用半微量凱氏定氮法。

1.2.1.2 工藝流程 文冠果脫脂粉→堿溶、浸提→離心→等電點沉淀→洗滌→冷凍干燥→文冠果蛋白粉

1.2.1.3 文冠果蛋白的提取步驟［10－12］取一定量脫脂粉與雙蒸水按一定料液比混合，用1mol/L NaOH調至一定pH，于一定溫度下磁力攪拌器攪拌浸提30min，然后在4℃下以4000r/min離心20min。沉淀物再重復提取1次，合并2次上清液，用1mol/L HCl調pH至等電點以沉淀蛋白質，經靜置沉淀后，以雙蒸水洗滌沉淀3次，再用1mol/L NaOH回調pH至7.0，攪拌使沉淀復溶后真空冷凍干燥，即為文冠果蛋白粉。

1.2.2 堿溶酸沉單因素實驗

1.2.2.1 液料比的確定 分別設定液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1(mL/g)，50℃，pH 為 10 下浸提80min，研究液料比對蛋白質得率的影響，確定最佳的液料比。

1.2.2.2 pH的確定 液料比10∶1，分別選擇pH為8、9、10、11、12，其他實驗條件同 1.2.2.1，確定最佳的pH。

1.2.2.3 提取時間的確定 液料比10∶1，pH為10，分別選擇浸提時間為 40、60、80、100、120min，其他實驗條件同1.2.2.1，確定最佳提取時間。

1.2.2.4 提取溫度的確定 液料比10∶1，pH為10，浸提時間60min，分別選擇提取溫度為 30、40、50、60、70℃，研究提取溫度對蛋白質得率的影響，確定最佳提取溫度。

1.2.3 堿溶酸沉工藝優化實驗 結合單因素實驗結果，采用Box－Behnken進行實驗設計，選取液料比(mL/g)、pH、提取時間(min)及提取溫度(℃)為影響因素，采用四因素三水平的響應面法進行實驗，利用Design－Expert7.1.6軟件進行數據處理和回歸分析。分別用A、B、C、D來表示4個影響因素，并以+1、0、－1分別代表變量的水平，蛋白質得率為響應值(即實驗指標)，實驗設計方案［13－15］見表 1。

表1 Box－Behnken方案設計的中心組合實驗因素和水平編碼表

1.3 分析方法

1.3.1 文冠果粗蛋白含量測定 粗蛋白按GB/5511－1985 方法進行［16－17］(即凱氏定氮法)。

1.3.2 文冠果水溶性蛋白含量測定 水溶性蛋白:采用考馬斯亮藍法［16］。以牛血清白蛋白(BSA)為標準品，繪制蛋白質標準曲線，建立回歸方程為A=0.0007C+0.0069，其中A為吸光度，C為蛋白質濃度(mg/mL)，R2=0.9995。

圖1 蛋白含量測定標準曲線

1.3.3 文冠果蛋白提取率計算

文冠果蛋白提取率(%)［6］=提取液中蛋白質含量/脫脂粉總蛋白含量×100%

注:提取液中蛋白質含量測定方法為考馬斯亮藍法;脫脂粉中蛋白質含量測定方法為半微量凱氏定氮法。

2 結果與討論

2.1 文冠果種仁粗蛋白含量分析

采用凱氏定氮法分析了陜西志丹產地的文冠果種仁粗蛋白含量，其值為22.40%。脫脂粉經堿溶酸沉、真空凍干后可獲得較純蛋白，經半微量凱氏定氮法測定其含氮量為6.5642%，蛋白質含量為82.06%。

2.2 蛋白質提取單因素實驗結果

2.2.1 液料比對蛋白質提取率的影響 按照1.2.2.1方法進行實驗，液料比對蛋白質提取率的影響實驗結果如圖2所示。

由圖2可知，隨著液料比的增大，蛋白質的提取率隨之升高。當液料比較小時，蛋白質提取率較低，可能由于文冠果中含有一定量的淀粉和纖維，具有較強的吸水膨脹能力，使物料流動性差難以攪拌，導致蛋白質提取率低。液料比大于10∶1(mL/g)時，蛋白提取率增加值已不明顯。所以液料比取10∶1(mL/g)較佳。

圖2 液料比對蛋白質提取率的影響

2.2.2 pH對蛋白質提取率的影響 按照1.2.2.2方法進行實驗，pH對蛋白質提取率的影響實驗結果如圖3所示。

圖3 pH對蛋白質提取率的影響

由圖3可知，隨著pH的升高，蛋白質提取率增加，且在pH等于10時提取率達最大值。pH大于10，則蛋白質提取率下降，pH太高可能會引起蛋白質變性，使得提取率有所降低。所以最佳提取pH為10。

2.2.3 提取時間對蛋白質提取率的影響 按照1.2.2.3方法進行實驗，提取時間對蛋白質提取率的影響實驗結果如圖4所示。

圖4 提取時間對蛋白質提取率的影響

由圖4可知，在時間小于60min時，曲線顯著上升，60min到達峰值，之后有明顯下降的趨勢。蛋白質溶出率越高，蛋白質提取率越高。當浸提時間達到60min時，蛋白質的溶出率達到動態平衡。所以蛋白質提取時間為60min較佳。

2.2.4 提取溫度對蛋白質提取率的影響 按照1.2.2.4方法進行實驗，提取溫度對蛋白質提取率的影響實驗結果如圖5所示。

由圖5可知，溫度的高低對文冠果蛋白質溶解度有較大的影響。隨著溫度的升高，蛋白質提取率增大。當溫度達到50℃時提取率達到最大，之后顯著降低。可能是因為蛋白質在50～60℃易受熱變性，使蛋白質提取率下降。所以最佳提取溫度為50℃。

圖5 提取溫度對蛋白質提取率的影響

2.3 堿溶酸沉提取工藝的優化

2.3.1 實驗結果 采用四因素三水平的響應面法進行堿溶酸沉提取工藝的優化，按照1.2.3的方法實驗，結果見表2。

表2 Box－Behnken方案設計及響應面法實驗結果

2.3.2 模型的建立及其顯著性檢驗 利用Design－Expert7.1.6軟件對表2實驗數據進行多元回歸擬合，得到文冠果蛋白質得率對液料比(A)、pH(B)、提取時間(C)及提取溫度(D)的二次多項回歸模型為:

Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C－0.49D－0.22AB－2.57AC+1.05AD+5.11BC+1.70BD+2.57CD－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2

對該模型進行顯著性檢驗，結果見表3，回歸模型系數顯著性結果見表4。

由表3方差分析結果可以看出，模型Model P=0.0004，模型達到顯著。失擬項Lack of Fit P=0.1950＞0.05不顯著，因此二次模型成立，應用此模型可以分析和預測蛋白質堿溶酸沉提取工藝的優化。

表3 回歸模型的方差分析結果

表4 回歸模型系數的顯著性檢驗結果

由表4回歸模型系數顯著性檢驗結果可知，模型的一次項 A、B、C均顯著，D不顯著，二次項均顯著，交互項BC顯著，其他交互項均不顯著。影響蛋白質提取率的因素依次為B＞A＞C＞D，即pH＞液料比＞時間＞溫度。

剔除不顯著項后的數學模型為:

Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C+5.11BC－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2

2.3.3 文冠果蛋白質堿溶酸沉提取工藝的響應面分析與優化 根據回歸模型做出相應的響應曲面圖見圖 6～圖11。

圖6 液料比與pH的交互作用影響的響應曲面和等高線

由圖6～圖11可知，液料比與pH之間的交互作用、液料比與提取時間之間的交互作用、液料比與提取溫度之間的交互作用、提取時間與提取溫度之間的交互作用、pH與提取溫度之間的交互作用均不顯著，僅有pH與提取時間之間的交互作用顯著。

2.3.4 提取條件的優化［18－19］通過專業軟件分析，堿溶酸沉提取文冠果種仁蛋白質的最佳工藝條件如表5所示。

圖7 液料比與提取時間的交互作用影響的響應曲面和等高線

圖8 液料比與提取溫度的交互作用影響的響應曲面和等高線

圖9 pH與提取時間的交互作用影響的響應曲面和等高線

圖10 提取時間與溫度的交互作用影響的響應曲面和等高線

圖11 提取溫度與pH的交互作用影響的響應曲面和等高線

表5 提取率最佳的各個因素組合

由表5可知，文冠果蛋白的最佳提取工藝參數為:液料比10.59∶1(mL/g)，pH10.6，時間 73.4min，溫度41℃，在此條件下，蛋白質提取率理論值為84.66%。為檢驗響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優化提取條件進行文冠果蛋白質提取，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數修正為:液料比11∶1(mL/g)，pH11，時間 73min，溫度 41℃。在此條件下提取，實際測得的平均得率為83.58%，與理論值較接近，因此，基于響應面法所得的優化提取工藝參數準確可靠，進一步驗證了數學回歸模型的合適性。

3 結論

3.1 本實驗在研究堿溶酸沉法提取文冠果蛋白質時各因素對提取率的影響的基礎上，采用了響應面分析法對蛋白質提取工藝進行優化。

3.2 響應面法優化堿溶酸沉提取文冠果蛋白的最佳工藝條件為:液料比 11∶1(mL/g)，pH11，時間 73min，溫度 41℃，在此條件下，文冠果蛋白質得率可達84.66%。

3.3 在本實驗范圍內，各影響因素對蛋白質提取率作用的大小依次為:pH＞液料比＞時間＞溫度。

3.3 利用響應面分析法得到的二次多項式回歸方程數學模型Y=82.64+3.98A+3.56B+3.04C+5.11BC－4.40A2－6.63B2－5.89C2－6.79D2，能較準確地預測實驗結果。

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Study on the optimization of extraction processing for Xanthoceras sorbifoLia bunge kernel protein by alkali－solution and acid－isolation

DENG Hong，TIAN Yun－yun，TIAN Zi－qing，QIU Nong－xue，GUO Yu－rong
(College of Food Engineering and Nutritional Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

TS201.2+1

B

1002－0306(2010)08－0197－05?

2009－07－01

鄧紅(1945－)，女，副教授，碩士生導師，主要從事食品分離技術研究。

農業部公益性項目(nyhyzx07－024);農業部蘋果產業體系(nycytx－08)項目資助。