糖心康對糖尿病大鼠心肌組織基因膜聯蛋白A4 mRNA表達的影響＊

王 兵，姜德友△，劉春紅，柳成剛，郭加利，郭偉光，陳 強，江正龍，張海麗，王書惠

（1.黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；

2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院，黑龍江 哈爾濱 150001）

糖尿病心肌損傷系糖尿病（DM）常見慢性并發癥之一，其病變可以是原發的，也可繼發于冠狀動脈供血障礙，且心肌病變出現較早，主要表現為心肌舒張和收縮功能障礙，易發生充血性心力衰竭。其確切的病理機制尚未徹底闡明，臨床尚無特效藥物，而中醫藥在防治該病方面很有潛力，但因其病理機制復雜，其狀態的描述和中藥復方多成分、多環節、多靶點的作用機制，又是傳統單因素研究理論與方法難以解決的。為此，借助分子生物學研究方法，采用基因芯片技術，利用目前國際學術界公認的Affymetrix公司生產的Rat 2302.0基因芯片，尋找糖尿病心肌病相關基因，探討糖尿病心肌病分子生物學機制，闡釋中藥復方糖心康治療糖尿病心肌病的作用機理，對STZ誘導DM大鼠的心臟基因表達譜進行了研究，并對篩選出的差異表達基因用 Eve green實時熒光RT-PCR技術檢測其在大鼠心臟組織中的含量及表達水平。本文僅報告糖心康對糖尿病心肌病大鼠心肌組織基因annexin A4 mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和藥品

鏈脲佐菌素（STZ，CALBIOCHEM，USA）；糖心康為黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制劑室制作；Rat 2302.0基因芯片（AFFYMETRIX，USA）。

1.2 動物造模及分組

Wistar雄性大鼠，體重200g～230g，除空白對照組外，余者以 25 mg·kg－1STZ左下腹腔注射，每天上午注射1次，連續5d。造模前12h禁食不禁水，造模1h后大鼠自由飲水、進食，造模1周后測血糖，血糖值在16.7mmol/L以上者皆認為造模成功。再隨機分為模型組、治療組，2組均喂以高熱量飼料（高熱量飼料由1％膽固醇、10％豬油、10％蛋黃粉、1％蔗糖、78％基礎飼料制成）13周，共喂養26周。

1.3 給藥方法

治療組以中藥糖心康灌胃，空白組及模型組以生理鹽水灌胃。

1.4 標本采集

快速用180℃12 h處理過的手術剪刀摘取心臟，立即用預冷的生理鹽水沖洗，沖洗后在冰上操作，沿心室長軸切取心肌置于液氮中凍存，以備提取RNA使用。

2 心肌組織差異表達基因的篩選

2.1 總RNA提取

從各組大鼠中取心臟，使用 QIAGEN's RNA easy Total RNA Isolation Kit抽提總 RNA，由純化的總RNA合成雙鏈 cDNA，經 PLG提取、乙醇沉淀將雙鏈 cDNA純化，用 BioArray High Yield RNA Transcript Labeling Kit方法以生物素標記cRNA合成，QIAGEN Rneasy Columns法體外轉錄純化生物素標記的cRNA，用分光光度計分析RNA濃度進行質控，凝膠電泳檢測 IVT產物，片斷化 cRNA，合成cRNA探針。

2.2 基因芯片的雜交、洗脫、染色及檢測

合成好的cRNA探針經片段化處理后用于與基因芯片雜交。基因芯片為Affymetrix Rat 2302.0基因表達譜芯片，芯片的雜交、洗脫、染色及檢測利用Affymetrix公司生產的專用設備“基因芯片檢測工作站”（work station）進行，操作過程均按該公司推薦的條件進行。

2.3 基因芯片檢測數據的處理

芯片掃描數據應用“Affymetrix Microarray Suite software 5.0”進行數據處理。

2.4 結果

篩選標準說明：差異基因篩選標準為change為I或 MI，ratio＞或 =1，實驗組 Detection為 P的為上調基因，change為D或 MD，ratio＜或 =－1，對照組Detection為P的為下調基因。

散點圖X軸為對照組信號值，Y軸為實驗組信號值，圖中紅色點為實驗組和對照組該基因的Detection均為 P，藍色為2組中有1個值不是 P，而黃色點為2組均為A（圖1）。

圖1 a.模型組/空白組灰度掃描圖；b.模型組/空白組散點圖c.治療組/模型組灰度掃描圖；d.治療組/模型組散點圖

按照比較嚴格的條件篩選出差異表達基因，表達差異2倍以上的基因列表，包括基因名稱、GenBank號、Uni號和染色體定位。其中，BM385237：annexin A4（anxa4），即膜聯蛋白 A4，在糖尿病大鼠心肌組織表達下調，糖心康治療組表達上調。

3 結果

3.1 空腹血糖、糖化血紅蛋白水平變化

表1顯示，實驗結果表明，模型組大鼠空腹血糖（FBG）及糖化血紅蛋白（HbA1C）水平明顯升高，與正常組相比較，差異顯著（P＜0.01），說明鏈脲佐菌素造模成功。治療組較模型組有較大幅度降低，2組比較差異顯著（P＜0.01），但較正常組仍高，說明糖心康有良好的降糖、減輕蛋白非酶糖基化的作用。

表1 各組空腹FBG、HbA1c水平比較±s）

表1 各組空腹FBG、HbA1c水平比較±s）

注：與正常組比較：*P＜0.01；與模型組比較：ΔP＜0.01

組 別 n FBG（mmol/L） HbA1c（％）正常組10 5.19±0.49 3.75±0.51模型組 10 20.53±3.55* 8.62±1.77*治療組 10 10.74±2.54Δ 6.86±1.10Δ

3.2 心肌組織病理及超微結構變化

3.2.1 光鏡下觀察 圖2～4顯示，正常組：心肌纖維走行正常，無肥大，心肌細胞核呈圓形或橢圓形，居細胞中央，心肌間質及微血竹等結構正常。模型組：心肌纖維肥大，心肌纖維有大量灶性 PAS陽性物質沉積，心肌纖維出現散在或多處大小不等的局灶性、片狀壞死；心肌毛細血管管腔狹窄、管壁增厚，有大量糖蛋白沉著、管壁內皮增生伴乳頭狀凸起，8周、15周、22周呈進行性加重。治療組：心肌纖維肥大較輕，心肌內有少量PAS陽性物質沉積，心肌走行基本正常。

圖2 正常組心肌HE染色（400×）

圖3 模型組心肌HE染色（400×）

圖4 治療組心肌HE染色（400×）

3.2.2 電鏡下觀察 圖5～7顯示，正常組：心肌肌原纖維結構清晰，肌絲排列整齊，各帶明顯，細胞核發育良好，線粒體結構完好。呈圓形或橢圓形、嵴規則、無腫脹、變性等，線粒體及肌絲間糖原顆粒豐富正常，相鄰心肌纖維處可見閏盤連接，心肌纖維間可見許多微血管，毛細血管基底膜無增厚。模型組：心肌肌原纖維走行紊亂，肌節破壞斷裂，長短不一，肌絲灶性溶解、消失，肌漿網擴張，可見細胞核異形變。核周邊有切跡，或固縮、染色質邊集，亦可見核內空泡樣變，核膜模糊斷裂，核周細胞器呈點狀、碎片狀等變化，肌漿網囊狀擴張，多數線粒體腫大，嵴斷裂溶解，呈絮狀、水鞘圖樣及空泡樣變，線粒體膜下和基質內及核膜下電子密度增大（鈣鹽沉積），肌細胞線粒體間糖原散在，閏盤排列有斷裂現象，壞死的心肌細胞附近可見成束的膠原結締組織，成纖維細胞增生活躍。心肌細胞間可見少量吞噬細胞，毛細血管腔變窄甚至閉塞，內皮細胞肌膜斷裂，核染色體邊集，基底膜增厚。8周時心肌超微結構即出現異常改變，15周時加重，22周時病變更為嚴重。治療組：心肌肌原纖維大都排列整齊，肌節發育良好，明暗帶分明，未見肌絲溶解，肌漿網擴張減輕，細胞核發育良好，未見異形樣變，核周有大量豐富的發育良好的線粒體，仍可見少量灶性絮狀樣變，未見鈣鹽沉積，肌絲及線粒體間糖元顆粒較豐富，閏盤排列緊密，肌細胞間可見增多的毛細血管。

3.3 熒光定量RT-PCR對心肌組織annexin A4 mRNA表達的檢測

采用 Eve green 法，sense primer：5′-CAA ACA CAC GTG GTC TGC CTA-3′，length：21 bp，Tm 值：58℃；anti-sense primer：5′-TTG TAC CCT GCC ACC ATT TTC-3′，length：21 bp，Tm 值：58℃；product length：101 bp，product Tm 值：78℃ 。

3.3.1 RNA樣品反轉錄 使用TAKARA公司的RNA PCR kit反轉錄試劑盒，按照試劑盒提供的反應體系進行反轉錄反應。反轉錄體系10 μL，30℃反應10 min，42℃反應30min～50min，95℃加熱5 min，4℃反應5 min中止。

3.3.2 心肌組織 annexin A4 mRNA表達水平的檢測結果 表2顯示，在實時熒光定量PCR技術中，為了定量和比較的方便，引入熒光閾值（threshold）和 CT（threshold value）值的概念。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的1個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，CT值與起始模板的關系為每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，CT值越小。模型組大鼠心肌組織中 annexin A4 mRNACT值上調，說明annexin A4 mRNA在心肌組織表達量減少，與空白組比較差異顯著（P＜0.05）。而經糖心康治療后大鼠心肌組織中annexin A4 mRNACT值下調，說明糖心康能增加 annexin A4 mRNA在心肌組織的表達量，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05）。

表2 各組annexin A4 mRNA的表達水平比較

4 討論

本研究以《金匱》治療消渴病理法及相關論述為指導，并結合臨床經驗，根據該病氣陰兩虛血瘀網絡式錯綜復雜的病變性質，主張隨病證宜多法聯用，從而確定了益氣養陰活血為該病的主要治法，研制出中藥復方糖心康，由太子參、黃芪、麥冬、玉竹、枸杞、丹參、土鱉蟲等藥組成。方中太子參與黃芪配伍，以增強益氣之效，合枸杞、麥冬、玉竹共收益氣養陰之功。丹參伍用土鱉蟲增強活血化瘀之力。諸藥相合，補而不滯膩，通而不傷正，滋而不助濕，溫而不傷陰，共奏益氣養陰、通絡化瘀之效。

BM385237：annexin A4，膜聯蛋白 A4（anxa4）。膜聯蛋白家族（annexins）是一類與Ca2+結合后可進一步與膜磷脂結合的鈣依賴性磷脂結合蛋白，迄今為止，從真菌、原生生物到植物、高等脊椎動物等超過65種不同種屬范圍內，已發現160種以上的annexins成員。在哺乳動物中有 12種，命名為ANXA 1-A 11、A 13，它們廣泛存在于細胞質膜下、儲Ca2+細胞器附近以及在核內或細胞外基質中。從免疫交叉反應及其蛋白質和cDNA序列分析結果證明，它們在結構上具有相似性，功能上也有許多相同點。Annexins家族都具有高度保守的C端中心結構域和獨特的N末端。中心是由4～8個同源重復序列形成的一個略有彎曲、具有凹凸兩面的盤狀結構，每個重復序列由約70個氨基酸形成的5個a-螺旋連接成緊密的結構域。C端有蛋白水解位點、磷酸化位點以及與其他蛋白質結合的位點，是annexins的調節區域。Annexins各成員N端的序列長度各不相同，僅在蛋白激酶的磷酸化位點上序列相近。有實驗證明，N端輕微改變不影響總體盤狀結構，但在功能上影響凸面Ca2+依賴的磷脂結合功能，從而改變其分子生物學特征。目前針對annexins的生物學功能還只是一些初步研究，它們在細胞中發揮諸如抑制磷脂酶A2活性、參與細胞骨架活動、參與磷脂化與膜受體的功能調節、抗凝、傳導有絲分裂信息以及促進細胞分泌等重要生物功能。對annexins早期研究主要集中在其參與炎癥機理的反應方面。近年來，越來越多的研究發現，其在腫瘤的發生發展過程中可能發揮重要作用，如介導凋 亡、分 化 等。 且 以 annexinA1、annexinA2、annexin A5的相關報道較多，而中藥復方對糖尿病狀態下annexin A4調控研究未見專門報道。

膜聯蛋白A4（anxa4）屬于膜聯蛋白家族，其基因定位于2p13，該蛋白廣泛存在于動植物的各組織器官，約占細胞內蛋白質總量的2％。其是Ca2+依賴的磷脂結合蛋白，具有磷脂酶抑制因子、與鈣離子結合、與鈣依賴磷脂結合的活性，可促進膜融合，參與囊胞運輸、鈣離子通道形成、細胞骨架活動、磷脂化與膜受體的功能調節以及胞吞、胞吐和分泌等重要生物學功能。新近文獻報道，annexins A4可能具有調節細胞生長分化、細胞凋亡等多種生物學功能，而這些生物學行為失調可能與糖尿病心肌損傷的發生具有較強的相關性。有研究證明，annexins A4可以抑制細胞內Ca2+水平升高，維持細胞內Ca2+水平的穩定，從而避免心肌收縮功能異常，同時還可能增強細胞對凋亡的抵抗能力。

本實驗基因芯片結果顯示，annexins A4在糖尿病狀態心肌組織表達下調，提示糖尿病心肌病的發生可能與annexins A4的基因調控有關，其機制可能在于：（1）鈣調控失衡引起心肌收縮功能異常，導致或加重糖尿病性心肌病大鼠心肌損傷；（2）不利于心肌細胞骨架結構的形成；（3）心肌細胞生長、分化或凋亡異常導致心肌損傷。

本實驗結果表明，糖尿病性心肌病時 annexins A4 mRNA呈低表達，而應用中藥復方糖心康后，annexins A4 mRNA表達上調，說明糖心康可通過上調糖尿病大鼠心肌組織annexins A4 mRNA的表達，保護心肌組織，延緩疾病進一步發展。