重慶墊江牡丹皮HPLC指紋圖譜研究（Ⅲ）——刮丹皮指紋圖譜

張艷，范俊安，夏永鵬，邱宗蔭，李隆云，王賓豪（.重慶市中藥研究院重慶市中藥良種選育與評價工程技術研究中心，重慶市 400065；.重慶市食品藥品監督管理局，重慶市 40004；.重慶醫科大學藥學院，重慶市 40006）

牡丹皮又稱丹皮，為毛莨科植物牡丹Paeonia suffruticosaAndr.的根皮[1]。重慶墊江縣種植牡丹皮歷史悠久[2]，是全國三大牡丹皮主產地之一。在秋季采挖牡丹根刮去表皮抽去木心曬干為刮丹皮，只抽去木心不刮表皮直接曬干為原丹皮。目前，牡丹皮質量分析與控制的主流指標是丹皮酚含量測定[3]。筆者對重慶墊江牡丹皮進行了系統的質量分析[4]，本文著重報告對刮丹皮的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究結果。

1 材料

1.1 儀器與試藥

2695-2996型HPLC儀，包括PDA檢測器等（美國Waters公司）；ZX98-1型旋轉薄膜蒸發器（上海有機化學研究所）；KQ-600型超聲清洗器（鞏義市英峪予華儀器廠）；植物粉碎機（北京鑫環亞科技有限公司）。丹皮酚、芍藥苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110708-200205、110736-200220）；提取用甲醇（分析純，重慶川東化工（集團）有限公司化學試劑廠）；HPLC流動相用甲醇（色譜純，美國默克公司）。

1.2 藥材

從重慶墊江縣牡丹皮種植基地采集主要栽培品種紅花牡丹植物標本及刮丹皮樣品10批（材料見表1），采樣地點根據種植基地的實際分布情況[2]設計，采樣點的土壤、海拔及采收時間等根據墊江牡丹皮最適宜的種植條件設計并相對固定（有關墊江牡丹皮最適種植條件的研究另文[5]發表），以確保樣品具有代表性。樣品及原植物經筆者鑒定為毛茛科芍藥屬植物牡丹P.suffruticosaAndr.。

2 方法與結果

2.1 方法

表1 墊江刮丹皮標準指紋圖譜研究試驗材料Tab 1 Test materials used for the study of fingerprints of shaved P.suffruticosa from Dianjiang county

檢測及分析方法與重慶墊江原丹皮HPLC指紋圖譜研究方法相同[5，6]。

2.2 結果

共測定10批樣品，將所得原始數據經專用軟件進行匹配分析（以刮丹1.cdf為參考模板，10個樣品指紋圖譜匹配后自動生成1個對照指紋圖譜），得到共有峰12個。各色譜峰保留時間的RSD均＜1%，2個標志性成分峰面積的RSD分別為芍藥苷21.52%、丹皮酚15.67%；以丹皮酚峰的峰面積為1計算各共有峰的相對峰面積即為各樣品色譜圖的指紋信息，樣品間各共有峰相對保留時間的RSD均＜0.5%，芍藥苷相對峰面積的RSD＝22.26%。墊江刮丹皮10批樣品HPLC指紋圖譜相似度分析結果見表2；共有峰數據見表3；匹配圖譜見圖1。

表2 墊江刮丹皮10批樣品HPLC指紋圖譜相似度分析結果Tab 2 Similarities of the HPLC fingerprints of 10 Patches of shaved P.suffruticosa from Dianjiang county

表3 墊江刮丹皮10批樣品指紋圖譜共有峰數據Tab 3 Chromatographic data of common peaks in HPLC fingerprints of 10 Patches of shaved P.suffruticosa from Dianjiang county

除少數樣品之間的兩兩相似度小于但十分接近0.9外，其余各樣品之間的兩兩相似度均＞0.9。10批刮丹皮樣品的色譜峰出峰時間、順序、整體峰形基本一致，各樣品化學成分基本相同，質量相似度高，相互差異較小，指紋圖譜共性特征明顯；同時也表明10批刮丹皮樣品具有很強的代表性，能夠代表墊江刮丹皮的質量特征。生成的對照圖譜（圖中標識為R）與所有樣品的相似度均＞0.9，而且除2個樣品外其余均＞0.95，表明生成的對照圖譜能夠代表墊江刮丹皮10批樣品的共同特征，可以作為墊江刮丹皮標準指紋圖譜。

圖1 墊江刮丹皮10批樣品HPLC指紋圖譜匹配圖譜A.匹配前圖譜；B.匹配后圖譜Fig 1 Matched HPLC fingerprints of 10 batches of shavedP.suffruticosa cultivated in Dianjiang county A.Pre-matched fingerprints；B.matched fingerprints

各樣品指紋圖譜共有峰占總峰面積的比例為83.53%～96.28%，平均為90.61%，RSD＝5.32%，非共有峰面積占8.39%＜10%，表明匹配過程中特征峰提取較為充分，作為非共有峰省略的信息很少；相似度和共有峰面積比例均符合國家食品藥品監督管理局和國家藥典委員會關于中藥注射劑指紋圖譜研究的相關技術要求[7，8]，故匹配所得12個共有峰能夠充分表達墊江刮丹皮的質量特征。其中，由于峰k的峰面積小，相對峰面積不到0.05，而且與10號峰時間間距很短，實際檢測應用中峰k信息可并入10號峰。因此，將峰k之外的其它11個共有峰標定為墊江刮丹皮的標準指紋圖譜特征峰，并以出峰時間順序依次編號，其中4號峰為芍藥苷，11號峰為丹皮酚。墊江刮丹皮標準HPLC指紋圖譜色譜數據見表4；標準指紋圖譜見圖2。

3 討論

以共有峰信息作為指紋圖譜能夠充分表達墊江刮丹皮的質量特征；10批樣品共有峰面積的RSD和相對峰面積的RSD均較大，表明各樣品的化學成分存在量上的明顯差異，以單一成分的含量測定不能科學判斷藥材質量；但單峰面積超過20%的色譜峰只有丹皮酚和芍藥苷峰，其它峰的單峰面積均未達到10%，而芍藥苷峰相對峰面積的RSD＝22%，明顯小于其它峰，表明芍藥苷含量相對穩定。因此，建議在丹皮酚之外增加芍藥苷作為牡丹皮質量控制的一個重要的定量指標。

從安徽、河南、湖北、山東等產地收集刮丹皮樣品，另從重慶中藥材市場收集產地標識為“重慶”的刮丹皮（樣品A），在相同色譜條件下檢測指紋圖譜，并與本文建立的墊江刮丹皮標準指紋圖譜進行對比分析。結果，各產地樣品與墊江刮丹皮標準指紋圖譜的相似度均＞0.9，但與標準指紋圖譜相匹配后，缺失了3號、5號和6號3個特征峰，總峰面積和共有峰面積均顯著減少；芍藥苷峰的相對峰面積均明顯低于標準指紋圖譜，表明墊江刮丹皮與安徽、河南、湖北、山東等產地的刮丹皮相似度高，但仍存在區別。樣品A具有墊江刮丹皮標準指紋圖譜的所有特征峰，且與標準指紋圖譜的相似度達0.958；而與安徽、河南、湖北、山東各產地樣品間的相似度均＜0.9（各產地樣品間兩兩相似度均＞0.9），其中最小的與湖北刮丹皮的相似度僅為0.754；總峰面積、芍藥苷峰的相對峰面積與標準指紋圖譜十分接近，表明樣品A與各產地樣品區別大而與重慶墊江刮丹皮標準指紋圖譜相似度高；結合樣品A外觀性狀與重慶墊江刮丹皮基本相同的情況，可以認定樣品A就是重慶墊江產刮丹皮。這些試驗進一步證明了指紋圖譜可以作為牡丹皮質量控制和產地鑒別的重要參考依據。

表4 墊江刮丹皮標準HPLC指紋圖譜色譜數據Tab 4 Chromatographic data of standard HPLC fingerprints of shaved P.suffruticosa cultivated in Dianjiang county

圖2 墊江刮丹皮HPLC標準指紋圖譜4.芍藥苷；11.丹皮酚（參照峰）Fig 2Standard HPLC fingerprints of shaved P.suffruticosa cultivated in Dianjiang county4.paeoniflorin；11.paeono（lreference peak）

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學工業出版社，2005：119.

[2]范俊安，張 艷，夏永鵬，等.重慶墊江牡丹皮歷史考證與生產現狀分析[J].中藥材，2006，29（4）：401.

[3]范俊安，夏永鵬，申明亮，等.近15年牡丹皮研究文獻分析[J].中國中醫藥信息雜志，2006，13（6）：103.

[4]范俊安.重慶墊江牡丹皮質量分析與控制研究[C].重慶：重慶醫科大學，2006：58～80.

[5]范俊安，夏永鵬，邱宗蔭，等.重慶墊江牡丹皮HPLC指紋圖譜研究（Ⅰ）——不同因素的影響及牡丹皮最適宜種植條件選擇[J].中國藥房，2009，20（21）：1 667.

[6]張 艷，范俊安，夏永鵬，等.重慶墊江牡丹皮HPLC指紋圖譜研究（Ⅱ）——原丹皮指紋圖譜[J].中國藥房，2009，20（33）：2 602.

[7]國家藥品監督管理局.關于印發《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術要求（暫行）》的通知[Z].國藥管注[2000]348號，2000-08-15.

[8]國家藥典委員會.關于印發《中藥注射劑指紋圖譜實驗研究技術指南》的通知[Z].2002-04-27.