轉WMV-2CP基因西瓜中間試驗的農藝性狀評價

應奇才，徐祥彬，施農農，王慧中

(杭州師范大學 生命與環境科學學院，浙江 杭州 310036)

近年來，西瓜病毒病日趨嚴重，嚴重影響了西瓜的產量和品質，給農業生產造成了重大的損失。報道顯示，我國西瓜花葉病毒病的平均發病率超過30%，個別品種甚至高達100%，造成西瓜產量年平均減產30%～40%，經濟損失高達1.5億元左右。使用化學農藥殺滅病毒傳播介體 (如飛虱、葉蜱等)可以在一定程度上降低發病率。然而，對于病毒本身，由于其寄生于植株細胞內，與寄主細胞共存，人們難以找到既對病毒有殺傷作用又對寄主無損害的選擇性化學藥物。因此，選育西瓜抗病新品系或品種，對農業生產具有重要的理論和實踐意義。

1999年，作者采用基因工程方法，利用西瓜組織培養和農桿菌轉化技術成功地把WMV-2CP基因轉入浙密2號西瓜，獲得轉基因植株［1］。經過10年的培養試驗，獲得了大量的轉基因西瓜農藝性狀資料。本文主要對轉WMV-2CP基因西瓜后代農藝性狀進行分析，以便為進一步推廣轉WMV-2CP基因浙密2號西瓜提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

轉西瓜花葉病毒2號外殼蛋白基因西瓜 R1、R2代種子。

1.2 方法

1.2.1 西瓜基因組DNA提取

以轉WMV-2CP基因西瓜植株和未轉化的西瓜植株為材料，利用 CTAB法提取基因組 DNA［2］，作為PCR擴增模板。

1.2.2 PCR檢測轉WMV-2CP基因西瓜后代分離及基因飄移情況

根據WMV-2CP基因序列設計并合成2條引物［3］(引物由上海 Sangon 公司合成)，W1:5′-TCC ATG GCA GCC AAG GAG AAG GAA GG-3′;W2:5′-TTG TCG ACA ACA AAC ATT GCC GCA-3′。以轉WMV-2CP基因和未轉基因的西瓜DNA為模板，PCR擴增WMV-2CP基因。PCR反應體系均為:10 × Buffer 5 μL，10 mmoL·L-1dNTP 2 μL，PCR引物各25 mol，DNA 模板 1 μL(約 200 ng)，Taq酶2 U，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR反應步驟為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環33次;最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 轉基因植株病毒抗性檢測

WMV-2按常規方法摩擦接種于西葫蘆幼苗的子葉上，測定鑒別寄主的反應。接種20 d出現病葉發皺、葉緣鋸齒狀、葉片有濃綠皰狀突起等典型癥狀后，收集病葉，提純 WMV-2［4］。病毒制劑作適當稀釋后進行紫外吸收光譜測定，最低吸收峰在245 nm，最高吸收峰在260 nm，基本顯示一個核蛋白吸收光譜，磷鎢酸負染電鏡觀察表明，病毒粒為長約750 nm的柔性線條狀結構。

轉基因植株和陰性對照植株采用對比法種植，4月中旬播種，試驗地點分2組，1組在中國水稻研究所防蟲溫室，另1組在西瓜種植試驗區。4月下旬利用汁液摩擦接種病毒，檢測3個轉基因株系的抗病效果。溫室及大田試驗均設2次重復。

1.2.4 農藝性狀分析

轉基因浙密2號西瓜田間試驗主要對供試材料長勢、生物學性狀、含糖量、越冬能力以及產量等各項農藝性狀進行觀察記錄。

2 結果與分析

2.1 外源基因的飄移

取轉基因西瓜試驗區內其它植株80個樣品，對其進行PCR分析，結果沒有擴增出WMV-2外殼蛋白基因的特異性條帶。取轉基因西瓜試驗區10 m外其它植株60個樣品，對其進行PCR分析，沒有擴增出WMV-2CP基因的特異性條帶。取轉基因西瓜試驗區20 m外普通西瓜植株30個樣品，對其進行PCR分析，3個樣品擴增出WMV-2外殼蛋白基因的特異性條帶。取轉基因西瓜試驗區100 m外普通西瓜植株30個樣品，對其進行PCR分析，沒有擴增出WMV-2外殼蛋白基因的特異性條帶。

可見，本試驗為了防止目的基因擴散而采取的100 m內種植高桿植物，或以河流和建筑物隔離以防外源基因擴散的措施是有效的。

2.2 轉基因西瓜WMV-2CP基因的后代分離

PCR檢測結果表明，WMV-2外殼蛋白基因在轉基因自交子一代西瓜植株的分離比符合孟德爾3∶1的比例 (表1);由R1代植株自交得到R2代植株的WMV-2外殼蛋白基因的分離結果也符合孟德爾1∶2的分離比 (表2);R3代轉基因株系大部分為WMV-2外殼蛋白基因的純合體 (表3);R4代植株WMV-2外殼蛋白基因的純合度比R3代植株更高 (表4);R5代植株 WMV-2外殼蛋白基因的分離結果表明R5代植株為WMV-2外殼蛋白基因的純合體 (表5)。通過以上試驗結果分析可知，轉WMV-2CP基因西瓜的病毒抗性為顯性單基因遺傳，即轉WMV-2CP基因西瓜的WMV-2CP基因為顯性單基因遺傳。

表1 轉基因R1代植株WMV-2CP基因的分離

表2 轉基因R2代植株WMV-2CP基因的分離

表3 轉基因R3代植株WMV-2CP基因的分離

表4 轉基因R4代植株WMV-2CP基因的分離

表5 轉基因R5代植株WMV-2CP基因的分離

2.3 轉WMV-2CP基因西瓜病毒抗性

抗病性試驗結果表明，對照植株接種西葫蘆病葉汁液后，主要表現為花葉，頂部葉片出現濃、淡相同的綠色斑駁，病葉細窄、皺縮，植株矮小、萎縮，花器發育不良，不易坐果，即使結果，瓜也較小，接種的20株對照株平均單果重僅4.1 kg。而轉基因 R1、R2、R3、R4、R5代植株 (各 30株，T7、T11和T32各10株)接種西葫蘆病葉汁液后發病時間明顯遲于對照株。轉化株T7平均接毒后45 d開始發病，轉化株T11平均接毒后40 d開始發病，而轉化株T32平均接毒后65 d才開始出現病癥，表現出對WMV-2的高度抗性，30株轉化株都能正常開花結果。

將轉基因西瓜3個株系的第5代植株進行病毒接種，觀察接毒情況和病情發展。結果表明，轉基因植株的T5代株系于3葉期人工接種 WMV-2，接種后20 d開始調查發病情況，接種40 d左右達到發病高峰 (表6)。另外，西瓜采收時選取12株抗病性和農藝性狀好的單瓜繁殖下一代 (T7、T11、T32各4株)，抗病毒鑒測結果表明轉化株可以大大延緩發病時間，減輕發病程度。

表6 接種后40 d轉基因R5代植株發病情況

2.4 轉WMV-2CP基因陽性西瓜植株長勢、生物學性狀、含糖量及越冬能力

觀察結果表明，轉基因西瓜與未轉基因植株在長勢、生物學性狀以及含糖量之間沒有明顯的差異，其越冬能力和農藝性狀也沒有明顯差異。

2.5 產量分析

與未轉基因西瓜植株相比，不同的轉基因株系的瓜數、單瓜重以及產量均有不同程度的提高。其中株系R5T32瓜數較對照增加17.26%，單瓜重增加41.95%，產量增加18.86%(表7)。

表7 轉基因西瓜產量的變化

3 小結和討論

由以上的試驗結果可知:轉WMV-2CP基因浙密2號西瓜的抗西瓜花葉病毒的能力，相比浙密2號有顯著的提高，其中轉基因陽性株系 T32效果最好。其它陽性株系的農藝性狀與對照相比有一定的提高，但沒有顯著差異。因此，經過進一步食品及環境安全性評價，轉基因陽性株系T32可進行生產性試驗和推廣應用。

［1］王慧中，趙培潔，周曉云.農桿菌法轉化獲得轉基因西瓜植株 ［J］.浙江大學學報:農業與生命科學版，2000，26(1):111－113.

［2］Rogers S O，Bendich A J.Extraction of DNA from milligram amounts of fresh，herbarium and mummified plant tissues［J］.Plant Mol Biol，1985(5):69 －76.

［3］劉俊君，彭學賢，莽克強.大豆花葉病毒基因組3′-端區域的克隆和序列分析 ［J］.生物工程學報，1992，9(3):201－204.

［4］Francing W.Purification and identification of a South African isolate of watermelon mosaic virus-Moroccs［J］.Phytopathology，1987，120:255－270.