LC-MS法測定人血漿中尼美舒利的濃度

劉煒，李曉曄，程維明#（1.北京世紀壇醫院藥劑科，北京市100038；.沈陽藥科大學藥學院，沈陽市110016）

尼美舒利（Nimesulide）屬于非甾體類解熱鎮痛藥，是第1個選擇性環氧化酶-2（Eyclooxygenase-2，COX-2）抑制劑，用于治療慢性關節炎、手術及急性創傷后疼痛和炎癥、耳鼻咽部炎癥所致的疼痛、上呼吸道感染引起的發熱、頭痛等，臨床研究表明，其有著良好的抗炎、鎮痛和退熱作用[1～3]。同時，尼美舒利還可用于其他慢性疼痛與炎癥的治療，并可作為癌癥三階梯止痛療法的第一階梯首選藥[4]。國內、外雖有關于尼美舒利血漿濃度測定方法的研究報道，但均是采用高效液相色譜法[5～7]，靈敏度和時效性不能滿足現代臨床藥學研究的要求。鑒于此，筆者首次建立了以纈沙坦為內標的測定人血漿中尼美舒利濃度的液-質聯用（LC-MS）法。結果表明，本方法靈敏、簡便、結果準確可靠，重復性好，可用于尼美舒利的臨床血藥濃度監測和藥動學研究。

1 材料

1.1 儀器

1200系列高效液相色譜系統，包括G1376A高效液相泵、G1367B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1365B多波長紫外檢測器、Hystar色譜工作站（美國Agilent公司）；micrOTOFQ 125質譜系統（美國Bruker公司）。

1.2 試藥

尼美舒利對照品（蘇州俞氏藥業有限公司，批號：050512）；內標：纈沙坦對照品（北京法瑪泰醫藥技術開發有限公司，批號：050789562）；乙腈為質譜純，其它試劑均為分析純，水為雙重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜及質譜條件

色譜柱：Agilent Zorbox SB-Cl8（50 mm×2.1 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%甲酸（65∶35）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：35℃；進樣量：10μL。

高分辨質譜數據在正離子狀態下采集，選擇m/z309（尼美舒利，[M+H]+）和m/z436（纈沙坦，[M+H]+）進行監測；毛細管電壓：4 500 V；干燥氣：氮氣；流速：4 L·min－1；干燥氣溫度：250℃；噴霧氣：氮氣；流速：0.8 L·min－1；離子掃描范圍：50～1 000m/z；質譜緩沖氣體：氬氣；流速：30 bar。

典型提取離子流色譜見圖1；質譜見圖2。

2.2 試驗溶液的制備

2.2.1 尼美舒利對照品溶液：準確稱取105℃干燥至恒重的尼美舒利對照品適量，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為1 μg·mL－1的對照品溶液，搖勻，備用。

圖1 典型提取離子流色譜Fig 1 Typical EIC

圖2 質譜Fig 2 Mass Spectra

2.2.2 內標溶液：準確稱取105℃干燥至恒重的纈沙坦對照品適量，置于1 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為5 μg·mL－1的內標溶液，搖勻，備用。

2.3 樣品處理

取血漿1.0 mL，置于具塞離心管中，加入內標溶液20 μL，渦旋混合30 s。加入提取溶劑乙醚3 mL，渦旋混合30 s后，15 000 r·min－1離心10 min，吸取有機層，置于5 mL離心管中，氮氣吹干。進樣前以乙腈-水（1∶1）100 μL復溶，吸取10 μL進樣。

2.4 靈敏度試驗

取空白血漿，加入尼美舒利對照品溶液適量，梯度稀釋，使血漿最終藥物質量濃度相當于1 ng·mL－1，進樣10 μL ，記錄m/z309的提取離子流的峰面積。以該峰面積對空白血漿中m/z309的提取離子流的峰面積進行比較，其S/N＝3.5，故尼美舒利的靈敏度為1 ng·mL－1。

2.5 標準曲線的制備

取空白血漿，分別加入尼美舒利對照品溶液及內標溶液適量，使血漿中尼美舒利藥物質量濃度相當于5、10、15、20、25、50 ng·mL－1，并且血漿中纈沙坦質量濃度為50 ng·mL－1，處理血樣并各進樣10 μL，記錄m/z309和m/z436的提取離子流的峰面積。以m/z309與m/z436的峰面積比值（Y）對尼美舒利血藥濃度（X）作圖，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y＝104.16X±6.99（r＝0.998 9）。結果表明，尼美舒利血藥濃度在5～50 ng·mL－1范圍內線性關系良好。

2.6 方法回收率及精密度試驗

用空白血漿將尼美舒利對照品溶液稀釋成不同質量濃度的標準含藥血漿樣品，按“2.3”項下方法處理并測定，各濃度日內重復測定3次，并連續測定3 d。計算方法回收率及日內、日間精密度，結果均符合生物等效性研究的方法學要求。回收率及精密度試驗結果見表1。

2.7 重復性試驗

制備低、中、高（5、10、30 ng·mL－1）3種濃度的提取前和提取后的2組樣品，每組樣品重復進樣5次，測定m/z309的提取離子流的峰面積，結果RSD＝5.89%，表明試驗重復性良好。

表1 回收率及精密度試驗結果（±s，n＝3）Tab 1 Results of recovery and precision（±s，n＝3）

表1 回收率及精密度試驗結果（±s，n＝3）Tab 1 Results of recovery and precision（±s，n＝3）

濃度/ng·mL－1 5 10 30方法回收率/%87.1±2.1 89.5±3.3 92.9±6.2 RSD/%5.3 5.1 6.4日內精密度%91.2±3.2 90.2±2.8 89.9±3.6 RSD/%5.1 3.1 5.8日間精密度/%89.9±3.6 90.2±4.5 89.5±6.6 RSD/%6.4 7.8 9.2

2.8 穩定性試驗

按“2.3”項下方法分別制備并處理低、中、高（5、10、30 ng·mL－1）3種濃度的3組血漿樣品，各組分別在室溫放置（6、12、24 h）、長期凍存（－20℃凍存1、2、3周）和凍融（1、2、3次）條件下進行測定以考察穩定性，結果見表2。

表2 穩定性考察結果Tab2 Stability of escitalopram

3 討論

筆者曾考查乙腈沉淀蛋白法和有機溶劑提取法對于尼美舒利提取率的影響，發現乙腈沉淀蛋白法的尼美舒利回收率較低，推測為蛋白對尼美舒利的結合作用造成損失，故采用乙醚提取法，提取效率高，操作簡便。

采用高效液相色譜法進行生物等效性試驗時，由于紫外疊加原理，內標與藥物、藥物與雜質之間均需要有一定的分離度才可以定量準確。采用LC-MS法，由于采取了選擇性離子監測，所以保證了目標物質的定性隔離，不再要求具有很高分離度的高效液相色譜條件，較常規的高效液相色譜法更具優勢。

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