酶解蛋清粉制備蛋清蛋白肽工藝條件研究

張治國，王君虹，陳新峰，周利亙，馮鳳琴

(1.浙江省農業科學院食品加工研究所，浙江 杭州 310021;2.浙江大學食品科學與營養系，浙江 杭州 310029)

蛋清粉是一種資源豐富、價格低廉的優質蛋白資源。蛋清粉腥味重、溶解性差、粘度大、受熱易凝固，這些性質限制了它在食品加工中的應用。蛋白酶解技術可使蛋白質部分降解，從而使其溶解性提高、粘度和熱凝固性降低，并可促使呈味氨基酸或小肽釋放，改善其風味［1］。此外，蛋白質酶解后產生的小肽比大分子蛋白質更易吸收，并能產生抗氧化、降血脂、降血壓等生理活性小分子肽［2－6］。因此，利用酶解技術對蛋清粉進行部分降解，可制備出既可滿足食品加工業需求，又具有有益生理活性的蛋清蛋白肽。鄭云［7］通過正交試驗研究了中性蛋白酶酶解蛋清蛋白，制備蛋清蛋白肽的工藝。本研究以蛋清粉為原料，探討堿性蛋白酶催化酶解蛋清粉，制備蛋清蛋白肽的工藝條件，以期為蛋清粉的深加工利用奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

蛋清粉，粗蛋白含量83.37%，購自大連綠雪蛋品發展有限公司。堿性蛋白酶購自南寧龐博生物工程有限公司。該酶由地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)2709發酵而來，酶活為200 000 U·g－1，最適酶解條件為 50～55℃，pH 值 8.0～8.5。

儀器有離心機、HH-4數顯恒溫水浴鍋、pHS-3C精密pH計等。

1.2 方法

配制5%蛋清粉溶液作為底物溶液，按照實驗設計調節底物溶液的pH值，在設定溫度的水浴鍋中溫育10 min后，加入設定量的酶進行酶解，酶解時間為所設計時間。水解過程中水浴控溫，每30 min震蕩混勻1次，并滴加濃氫氧化鈉溶液，使底物溶液的pH值維持在設定值。

水解結束后，按陳新峰等［8］的方法測可溶性肽含量，計算水解度 (DH)。

單因素實驗結果用Office EXCEL軟件包作圖。正交試驗結果采用SPSS 16.0 GLM中單變量方差分析程序處理，p<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 水解時間對水解度的影響

5%蛋清粉溶液，pH值8.0，溫度為50℃，加酶量為5 000 U·g－1蛋清粉，分別水解不同時間，測定水解度。結果表明，隨著水解時間的延長，水解度不斷上升。但水解5 h后，水解度上升幅度很小 (圖1中a)。因此，確定5 h為較優水解時間。

2.2 底物溶液pH對水解度的影響

5%蛋清粉溶液，溫度50℃，加酶量5 000 U·g－1蛋清粉，分別在不同 pH條件下水解5 h，測定水解度。結果表明，pH值8.5時水解度最高(圖1中b)。由此，確定pH 8.5為較優底物溶液pH值。

2.3 加酶量對水解度的影響

圖1 水解時間 (a)、底物溶液pH(b)、加酶量 (c)和酶解溫度 (d)對水解度的影響

5%蛋清粉溶液，pH值8.5，溫度50℃，分別在不同加酶量的條件下水解5 h，測定水解度。結果表明，在加酶量為4 000～8 000 U·g－1蛋清粉的范圍內，水解度隨加酶量的增加而逐漸升高。加酶量超過6 500 U·g－1時，水解度增幅很小 (圖1中c)。考慮到酶是導致工藝成本增加的主要因素之一，確定6 500 U·g－1為較優加酶量。

2.4 酶解溫度對水解度的影響

5%蛋清粉溶液，pH值8.5，加酶量為6 500 U·g－1蛋清粉，分別在不同溫度下酶解5 h，測定水解度。結果表明，以55℃條件下酶解的水解度最高 (圖 1中 d)。因此確定55℃為較優酶解溫度。

2.5 蛋清粉酶解工藝的優化

根據上述結果，確定水解時間、底物溶液pH、加酶量和酶解溫度的水平 (表1)。采用正交表L9(34)設計正交實驗，對蛋清粉酶解工藝條件進行優化，實驗結果見表2。

表1 正交實驗的因素與水平

極差分析及方差分析結果 (表2)表明，各因素對水解度的影響大小依次為:C>D>B>A，其中因素C對水解度的影響顯著 (F=28.92*)。比較各因素的均值 (k1至k3)，確定堿性蛋白酶水解蛋清粉的最優工藝條件為:A3B2C3D2，即水解6 h、底物溶液pH為8.5、加酶量7 000 U·g－1、酶解溫度為55℃。由于水解5 h后，延長水解時間并不會引起水解度的大幅度升高 (圖1中a及表2)，而且，延長水解時間增加能耗，導致工藝成本增加，因此，確定A2B2C3D2為較優酶解工藝。

表2 蛋清粉酶解工藝優化的正交實驗結果

2.6 結果驗證

對A3B2C2D3和A3B2C2D2進行驗證實驗，計算水解度。結果表明，這2種工藝條件均可較好地實現對蛋清蛋白的水解，其水解度分別達到84.18%和83.16%。由此可見，當底物溶液pH為8.5、加酶量7 000 U·g－1、溫度55℃時，水解時間縮短為5 h也可獲得好的水解度 (表3)。因此，確定A3B2C2D2為較優水解工藝條件。

表3 2種工藝條件的水解度結果

3 小結和討論

本研究未考察蛋清粉濃度對水解度的影響，因為預備實驗結果表明，5%的蛋清粉溶液穩定性較好，高于此濃度時，蛋清粉溶液易形成凝塊;低于此濃度時，所得蛋清蛋白肽溶液含量低，不利于后期噴霧干燥。此外，杜永盛［9］觀察了不同濃度的咸蛋清對蛋清蛋白水解度的影響，證實底物溶液的蛋白濃度為4.5%時，蛋清蛋白的水解度最高。這一濃度與本研究蛋清粉溶液中蛋白濃度接近。

鄭云［7］觀察了多種酶對蛋清蛋白的水解能力，認為中性蛋白酶的水解能力較好，堿性蛋白酶較差。通過正交實驗優化后，中性蛋白酶的水解度可達到80.8%。本研究選用地衣芽孢桿菌2709發酵產生的堿性蛋白酶，經正交實驗優化酶解工藝后，其對蛋清蛋白的酶解能力優于中性蛋白酶。這一結果表明，地衣芽孢桿菌2709發酵產生的堿性蛋白酶是一種適宜于蛋清蛋白酶解的酶。不同研究中堿性蛋白酶水解能力的差異可能是由于酶的發酵菌株不同，酶的剪切位點差異造成的。

此外，本研究雖優化出了堿性蛋白酶催化酶解蛋清粉的工藝條件，并得到較高的水解度，但酶添加量較高。因此，可利用各種蛋白酶水解能力互補的特性，進一步研究蛋清粉的多酶聯合水解工藝，以降低工藝中酶的成本，并進一步提高蛋清粉的水解度。

［1］Vioque J，Sánchez-Vioque R，Clemente A，et al.Partially hydrolyzed rapeseed protein isolates with improved functional properties ［J］.Journal of the American Oil Chemists＇Society，2000，77(4):447－450.

［2］周利亙，陳新峰，王君虹，等.乳源酪蛋白肽脫色工藝條件的研究 ［J］.浙江農業學報，2007，19(2):75－79.

［3］于國平.乳蛋白質中的生物活性肽 ［J］.中國乳品工業，1997，25(2):32－33.

［4］陳帥，左愛仁，范青生.牛乳蛋白酶水解特性研究 ［J］.食品工業，2003(6):49－51.

［5］顧瑞霞.乳與乳制品的生理功能特征 ［M］.北京:中國輕工業出版社，2000:50－60.

［6］周利亙，王君虹，陳新峰，等.三酶復合法提取大豆多肽工藝的研究 ［J］.浙江農業學報，2006，18(4):241－245.

［7］鄭云.蛋清蛋白肽生產工藝的研究 ［D］.北京:北京化工大學，2006.

［8］陳新峰，王君虹，洪狄俊，等.木瓜蛋白酶水解制備乳酪蛋白肽工藝條件的研究 ［J］.浙江農業學報，2008，20(2):123－126.

［9］杜永盛.酶解咸鴨蛋蛋清制取白蛋白肽的研究 ［D］.杭州:浙江大學，2006.