宣威女性肺癌患者肺組織中PAHS-DNA加合物的表達

楊凱云 黃云超 趙光強 雷玉潔 王昆

多環芳烴類物質是公認的化學致癌物之一。云南省宣威地區女性肺癌高發，其女性肺癌的平均調整死亡率高達120/10萬，宣威市來賓鎮女性肺癌死亡率甚至達到400/10萬人[1]，宣威地區室內燃煤污染被認為是宣威地區女性肺癌高發的主要原因之一，燃煤產生的大量多環芳烴物質可能是當地女性肺癌發病的主要危險因素。研究[2]表明宣威地區燃煤家庭室內空氣中苯并芘濃度比衛生標準準許濃度（0.1 μg/100m3）高很多，最高達到626 μg/100m3，超過衛生標準6 000多倍，當地婦女主要從事家務勞動，長期在煤煙污染中生活，受多環芳烴類物質影響尤為嚴重。我們采用免疫熒光（immunofluorescence）方法檢測宣威女性肺癌患者、宣威男性肺癌患者、非宣威女性肺癌患者以及肺良性病變患者肺組織中多環芳烴DNA加合物表達的差異，探討多環芳烴類物質與宣威女性肺癌的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 ①實驗組：收集2007年7月-2008年11月云南省腫瘤醫院胸心血管外科及胸外科經手術切除的宣威地區女性肺癌患者癌組織、癌旁組織（距癌組織邊緣的距離＜5 cm）和正常肺組織（距癌組織邊緣的距離＞5 cm）各20份。其中鱗癌6例，腺癌14例，年齡為31歲-72歲，平均為52.1歲；②對照組1：同期收集宣威地區男性肺癌患者癌組織、癌旁組織和正常肺組織各20份。其中鱗癌13例，腺癌7例，年齡為35歲-74歲，平均為55.7歲；③對照組2：同期收集非宣威地區女性肺癌患者癌組織、癌旁組織和正常肺組織各20份。其中鱗癌8例，腺癌12例，年齡為36歲-68歲，平均為54.3歲，患者來自昭通、寶山、昆明、麗江以及貴州盤縣等地區；④對照組3：同期收集宣威地區女性肺良性病變患者正常肺組織10例。年齡為29歲-61歲，平均為53.7歲；⑤對照組4：同期收集非宣威地區女性肺良性病變患者正常肺組織10例。年齡為32歲-63歲，平均為54.2歲，患者來自昆明、大理、玉溪等地區。

全部病例均進行問卷調查，包括性別、年齡、居住情況、生活習慣、燃煤情況、房屋住宅情況、飲食習慣、家庭經濟情況等，并復印患者胸片、B超、CT，以及纖維支氣管鏡、痰查細胞學檢查、術后病檢結果。所有病例均不吸煙，也未進行過放療及化療。

1.2 方法 ①手術取患者癌組織、癌旁組織、正常肺組織放置于-80oC冰箱保存；②組織脫水，透明，浸蠟，常規石蠟切片機切片：厚度為3 μm；③切片采用免疫熒光法染色，并進行熒光顯微鏡攝片及圖片分析。（一抗：苯并芘共價加合物單克隆抗體Benzo[a]pyrene(BAP-13):sc-51508；熒光二抗：羊抗鼠IgG-FITC: sc-2010。均購自美國Santa Cruz公司）。

1.3 結果判斷 PAH-DNA加合物在熒光顯微鏡下表現為綠色明亮的熒光，主要存在于細胞核，部分存在于細胞質。根據熒光強度分為：①強陽性（+++）：熒光閃亮，呈現明顯的亮綠色；②中度陽性（++）：熒光明亮，呈黃綠色；③弱陽性（+）：熒光較弱，但清楚可見；④陰性（-）：無熒光可見。

1.4 半定量測定 用IPP 6.0軟件進行圖像分析。把圖像中呈現黃色熒光區域作為AOI（area of interest）進行光密度測定分析。選擇測量面積（area）平均光密度（density mean）和累積光密度（integrated optical, IOD），結果以IOD值作為統計數據。

1.5 統計方法 應用SPSS 13.0軟件包進行卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 宣威地區女性肺癌患者與宣威地區男性肺癌患者肺組織中多環芳烴DNA加合物的表達 多環芳烴DNA加合物在細胞中主要表達于細胞核，部分表達與細胞質，其在宣威女性肺癌患者肺組織中的表達較宣威男性肺癌患者高，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 宣威地區女性肺癌患者與非宣威地區女性肺癌患者肺組織中多環芳烴DNA加合物的表達 多環芳烴DNA加合物在宣威女性肺癌患者肺組織中的表達較非宣威女性肺癌患者高，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 正常肺組織中多環芳烴DNA加合物的表達 多環芳烴DNA加合物在宣威女性正常肺組織中表達較高，在宣威男性、非宣威女性中的表達較低（表3）。

2.4 多環芳烴DNA加合物在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達趨勢 PAH-DNA加合物在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達有逐漸降低的趨勢，但差異無統計學意義（表4，圖1）。

3 討論

近年來女性肺癌發病率、死亡率有逐年增高趨勢，在許多國家其增幅甚至高于男性。中國云南省宣威地區一直是女性肺癌的高發區，其女性肺癌死亡率高達120/10萬，遠遠高于中國女性平均水平（22.9/10萬），而宣威來賓鎮虎頭村女性肺癌死亡率竟達到400/10萬人。

表 1 多環芳烴DNA加合物在宣威女性及男性肺癌患者肺組織中的表達Tab 1 The expression of PAH-DNA adducts in lung cancer tissues of Xuanwei female and male patients

表 2 多環芳烴DNA加合物在宣威女性及非宣威女性肺癌患者肺組織中的表達Tab 2 The expression of PAH-DNA adducts in lung tissues of Xuanwei female and Non-Xuanwei female patients

表 3 多環芳烴DNA加合物在正常肺組織中的表達Tab 3 The expression of PAH-DNA adducts in lung normal tissues

表 4 多環芳烴DNA加合物在癌組織、癌旁組織、正常組織中的表達趨勢Tab 4 The expression of PAH-DNA adducts in cancer, adjacent and nomal tissues

腫瘤是DNA損傷后修復失敗或修復出錯的結果，無論是內源性還是外源性的致癌物，幾乎均需要經過這一共同的關鍵步驟才能起致癌作用。而機體暴露于化學致癌物后所致的DNA損傷，最普遍、最重要的表現形式是DNA加合物。

每燃燒1 kg煤產生多環芳烴類物質可達6×105/μg-14×105/μg[3]。多環芳烴進入機體后經細胞色素P450和環氧化物水解酶、單加氧酶等代謝過程產生反式二羥環氧苯并芘（anti_benzo(a)pyrenediol_epoxide, BPDE），BPDE是直接的強致癌物，可以和DNA共價結合形成多環芳烴_DNA加合物（polycylic aromatic hydrocarbons adduct, PAHDNA adduct），或與蛋白質結合形成多環芳烴蛋白加合物。當基因復制到多環芳烴_DNA加合物位點時，則不能繼續復制，還可能發生突變或堿基缺失。多環芳烴蛋白加合物則通過反式作用因子來影響DNA復制及轉錄。當關鍵基因突變導致細胞失去正常調控時，就會引起細胞癌變[4]。多環芳烴與其它毒物一樣，在體內要經過代謝活化，產生生物活性，并經過代謝失活，排出體外。因此，代謝酶活性的強弱對多環芳烴的生物效應影響很大。PAH-DNA加合物不僅能反映出人體總的多環芳烴接觸量，還能反映出多環芳烴經人體代謝后致突變作用的實際含量，因此PAH-DNA加合物既是多環芳烴的接觸指標，又是其致癌作用的效應指標[5]。

圖 1 PAH-DNA加合物的表達（×400）。A：宣威女性肺癌癌組織；B：宣威女性肺癌癌旁組織；C：宣威女性肺癌正常肺組織；D：宣威男性肺癌癌組織；E：宣威男性肺癌癌旁組織；F：宣威男性肺癌正常肺組織；G：非宣威女性肺癌癌組織；H：非宣威女性肺癌癌旁組織；I：非宣威女性肺癌正常肺組織；J：宣威女性肺良性病變患者肺組織；K：非宣威女性肺良性病變患者肺組織。Fig 1 The expression of PAH-DNA adducts (×400). A: Tumor tissue of Xuanwei female lung cancer patient; B: Adjacent tumor tissue of Xuanwei female lung cancer patient; C: Normal tissue of Xuanwei female lung cancer patient; D: Tumor tissue of Xuanwei male lung cancer patient; E:Adjacent tumor tissue of Xuanwei male lung cancer patient; F: Normal tissue of Xuanwei male lung cancer patient; G: Tumor tissue of Non-Xuanwei female lung cancer patient; H: Adjacent Tumor tissue of Non-Xuanwei female lung cancer patient; I: Normal tissue of Non-Xuanwei female lung cancer patient; J: Normal tissue of Xuanwei female patient with benign lung lesion; K: Normal tissue of Non-Xuanwei female patient with benign lung lesion.

多環芳烴類物質與肺癌的關系國內外都已經研究得很多，但云南宣威地區卻有其特殊性。宣威地區女性幾乎不吸煙，但其肺癌發病率卻非常高，某些地區甚至超過男性。現認為主要與當地的室內燃煤污染有關。

宣威市位于滇東北部烏蒙山區，是云南省主要產煤基地，小煤窯遍及全縣，農民世世代代在室內挖坑為爐，多數家庭燃燒煙煤取暖做飯，爐子溫度不高，不能完全燃燒煤炭，加之室內通風不良，當地女性長年累月在煙霧中生活，受燃煤污染影響特別嚴重。相對室外來說，室內通風不暢可導致燃煤空氣污染比室外高出幾十甚至上百倍。WHO公布，柏林市中心空氣中可吸入顆粒物（particles with diameters of 10 μm or less, PM10）濃度為30 μg/m3，Bangkok路邊空氣中PM10濃度為240 μg/m3，而直接用火塘燃煤的室內空氣中PM10濃度高達3 000 μg/m3[6]。云南省疾病預防控制中心監測的結果發現：70%的時間段，宣威地區戶外空氣質量水平達國家標準[7]。然而燃煙煤農戶室內空氣中BaP濃度高達626 μg/100m3，超過其建議衛生標準6 000多倍，同時也遠遠超過焦爐頂工人暴露水平[8]。

藍青、何興舟等[9]研究發現：云南宣威地區煤層屬于晚二疊紀煤層，煤炭品種分類為煙煤。宣威地區煙煤燃燒產生的空氣懸浮顆粒物較無煙煤多，并且這些空氣懸浮顆粒物中有機物含量（占43%）也遠遠高于無煙煤，這些有機物大部分為多環芳烴類物質[10]。宣威肺癌死亡率分布也呈現明顯的地區差異，肺癌死亡率高低與使用燃料品種有關。燒煙煤死亡率最高，木柴、無煙煤次之。肺癌死亡率性別比值（男:女）各地差異較大，荷蘭為13.5:1，美國為1.8:1，中國為2.07:1，云南宣威地區為1.09:1，宣威來賓鎮為0.87:1。燒煙煤人群肺癌死亡年齡高峰提前，燒煙煤人群肺癌死亡率是非燒煙煤人群的1.70倍[11]。

宣威地區流行病學研究[12]發現：燒煙煤人群患肺癌危險性是非燒煙煤人群的6.05倍（OR=6.05）。回顧性隊列研究[13]發現：女性中燒煙煤人群肺癌死亡率是非燒煙煤人群肺癌死亡率的25.6倍（RR=25.6），歸因百分比為96%。暴露劑量反應關系研究[14]發現：伴隨1958年前燒煙煤人口百分比升高（0%-100%）肺癌年齡調整死亡率相應升高（2.08/105-174.21/105）；伴隨室內空氣中BaP濃度升高（356.0 ng/m3-2 485 ng/m3）肺癌死亡率相應升高（2.08/105-174.21/105）。

研究發現：多環芳烴代謝酶多態性對宣威地區女性影響也較男性大。GSTM1在日本、歐洲和北美人群中表達的比例高達40%-50%，在中國為35%-63%，在云南省宣威市女性人群中為34.2%，其相對危險度為2.39（1.25-4.56），高于男性[15]。

室內燃煤空氣中以苯并（a）芘為代表的大量致癌性多環芳烴類物質可能是宣威女性肺癌發病的主要危險因素之一，多環芳烴代謝酶的基因多態性可能是宣威地區女性肺癌發生發展的遺傳因素，這與我們研究的結果相符合。現在，宣威地區女性肺癌發病仍然呈增高趨勢，而且還呈年輕化趨勢，我們收治的宣威肺癌患者中，20多歲的人群屢見不鮮。我們認為，通過研究宣威地區女性肺組織中多環芳烴DNA加合物的表達，可以幫助我們進一步了解當地肺癌高發與燃煤污染、多環芳烴類物質污染的關系，并指導制定進一步的預防措施。