麥門冬合千金葦莖湯抑制A549細胞增殖作用及其機制

周宇輝 詹瑧 唐于平 段金廒 張旭

肺癌是當前發(fā)病率和死亡率增長最快的惡性腫瘤，對放療、化療和免疫治療的敏感性均較差，尋找有效的治療方法是當前肺癌治療亟需解決的問題。采用抗腫瘤中藥治療惡性腫瘤是具有中國特色的腫瘤治療方式。麥門冬合千金葦莖湯分別是《金匱要略》記載的主治肺痿肺癰的中醫(yī)古方，麥門冬湯主治“肺中氣陰虧虛”、千金葦莖湯清肺化痰活血，兩方合用，具有清熱養(yǎng)陰、潤肺降氣、祛瘀排膿之功，與現代中醫(yī)所認為之肺癌的主要病機“氣陰兩虛、熱毒痰瘀互結”[1]基本相符。現代也有人以其中一首方劑加味的方式應用于臨床來治療肺癌，本研究以人肺腺癌細胞系（A549）為主要對象，研究麥門冬湯合千金葦莖湯有效部位群對肺癌細胞株的抑制作用及可能的分子機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 肺癌細胞株A549和人胚肺成纖維細胞HFL-1均購自中科院上海生物細胞所。

1.1.2 藥物及處理 麥門冬湯合千金葦莖湯萃取部位，由南京中醫(yī)藥大學方劑重點實驗室制備，將麥門冬合千金葦莖湯（原藥材總計21.6 kg）進行水煎煮并揮發(fā)油提取，得到揮發(fā)油部分和水提液部分。將水提液濃縮后醇沉，醇溶液回收溶劑至無醇后，依次用環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，最后共得到8個部分樣品，樣品均配制成100 mg/mL的母液，-20oC保存，臨用前解凍。

1.1.3 主要試劑 培養(yǎng)液RPMI-1640為美國GIBCO公司產品；優(yōu)級新生牛血清為杭州四季青生物制品廠產品；胰蛋白酶為AMRESCO公司產品；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO）為AMRESCO公司產品；噻唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide, MTT]為AMRESCO公司產品；吉姆薩染液購自南京建成生物工程研究所；碘化丙啶（propidium iodide, PI）和RNaseA購自美國Sigma公司；Hoechst 33258染色劑為碧云天生物技術研究所產品；抗EGFR抗體和抗ERK1/2抗體購自美國Santa Cruz公司；抗β-actin抗體購自美國GenScript公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔和羊抗鼠IgG抗體均購自美國Immunology Consultants Laboratory公司；化學發(fā)光試劑ECL購自碧云天生物技術研究所；其余試劑均為國產分析純。

1.1.4 主要儀器及設備 CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific Forma），倒置顯微鏡（美國Olympus），酶標儀（美國Bio-Rad），FACScan型流式細胞儀（美國Becton Dickinson），Z-32K型高速冷凍離心機（德國HERMLE），-70oC 309L型低溫冰箱（日本SANYO），電泳儀（美國Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人非小細胞肺癌細胞A549和人胚肺細胞HFL-1用含10%小牛血清的RPMI-1640（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL，pH7.4）培養(yǎng)液，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數生長期的細胞進行實驗，分別用不同濃度的部位樣品處理細胞，未加藥組為對照組。

1.2.2 細胞增殖活性測定 采用噻唑藍（MTT）比色法。取對數生長期的A549細胞和HFL-1細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板，設對照組和不同部位濃度處理組（1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL），每組6個復孔。于作用后72 h，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37oC下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，加入DMSO溶解藍紫色顆粒后，以Ascent酶標儀檢測波長490 nm測定吸光度值（A值），實驗重復3次，按以下公式計算細胞生長抑制率。細胞存活率（%）=實驗組平均A值/對照組平均A值×100%。

1.2.3 形態(tài)學觀察 取對數生長期的A549細胞以每孔5×103個細胞接種于96孔板，培養(yǎng)過夜，于倒置顯微鏡下觀察不同部位分別作用A549細胞后24 h、48 h及72 h時細胞形態(tài)變化。

1.2.4 集落形成測定 采用平板克隆形成實驗。取對數生長期的A549細胞，以250個細胞/孔均勻接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，使細胞貼附，分別加入用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋的終濃度為1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL的部位樣品，每組3個平行孔，置37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，去除培養(yǎng)液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min，吉姆薩染液染色10 min，自來水沖洗，晾干，用Quantity One軟件計算克隆數，按以下公式計算克隆形成率和克隆形成抑制率?？寺⌒纬陕剩?）=克隆數/接種細胞數×100%；克隆形成抑制率（%）=1-（實驗組克隆數/對照組克隆數）×100%。

1.2.5 細胞生長周期分析 采用PI染色檢測細胞周期。收集藥物作用72 h的A549細胞，用PBS洗滌，1 000 rpm、10 min離心2次，將細胞沉淀充分混勻，緩慢加入1 mL冰乙醇（70%）固定保存于-20oC。檢測前PBS洗滌去除乙醇，1 200 rpm、10 min離心2次，加入PI（50 μg/mL）染液混均，4oC避光孵育30 min后，用流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司）進行DNA含量和細胞周期分析。所用軟件為Cellqest，低于G1期的細胞（亞G1期）為凋亡細胞，其占細胞總數的比例為凋亡細胞比例。

1.2.6 凋亡的細胞核形態(tài)學檢測 采用Hoechst 33258熒光染色。取對數生長期的A549細胞，均勻接種于預置蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別以RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋的終濃度為1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL的部位處理，同時設對照組，72 h后，吸棄培養(yǎng)液，進行Hochest 33258染色，方法參照說明書進行，染色后熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態(tài)學改變。結果判斷：正常細胞的細胞核呈現彌散均勻熒光，出現細胞凋亡時，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，甚至可見DNA熒光碎片。

1.2.7 Western blot檢測 用裂解液處理收集細胞，以蛋白提取樣品作SDS-PAGE，電泳后轉膜，封閉后加入一抗（抗體稀釋濃度為1:200），PBST洗膜3次，每次10 min；加入二抗工作液（稀釋濃度為1:5 000），PBST洗膜3次，每次10 min；浸于適量ECL化學發(fā)光試劑中（A液:B液=1:1）1 min，取出，室溫條件下用保鮮膜包置于暗盒中，壓片曝光30 s-3 min，洗片，用Quantity One軟件進行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0行統(tǒng)計分析，所有定量數據均以Mean±SD表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT比色法檢測的結果 麥門冬湯合千金葦莖湯8個提取部位分別作用A549細胞72 h后，第6部位即乙酸乙酯萃取部位各濃度細胞存活率明顯降低，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），提示乙酸乙酯萃取部位有明顯抑制細胞生長的作用，10 μg/mL和1 μg/mL乙酸乙酯萃取部位作用的細胞存活率＜50%，引起的細胞生長抑制作用明顯大于100 μg/mL乙酸乙酯萃取部位（P＜0.05）（圖1）。

2.2 不同濃度乙酸乙酯萃取部位對A549細胞和HFL-1細胞生長的影響 作用72 h后，不同濃度的乙酸乙酯萃取部位均有促進HFL-1細胞生長和抑制A549細胞的作用，同一濃度，HFL-1細胞存活率明顯高于A549細胞存活率，以10 μg/mL乙酸乙酯萃取部位組最為明顯，引起A549細胞生長抑制作用明顯高于100 μg/mL（P＜0.01）；同時，促進HFL-1細胞生長作用明顯高于其他濃度的藥物（P＜0.01）（圖2）。

2.3 細胞形態(tài)學觀察結果 在倒置顯微鏡下可見正常對照組細胞生長旺盛，分布密集，多呈多角形，細胞走向趨于一致，多角形細胞的細胞體飽滿、有2-3個扁平而長的突起，細胞核較大，呈卵圓形且多居中。用乙酸乙酯萃取部位處理A549細胞后，隨著作用時間的延長，細胞間隔增寬，突起縮短。細胞質減少，細胞體縮小，黑色顆粒增多（圖3）。

2.4 對A549細胞集落形成的影響 經不同濃度乙酸乙酯萃取部位處理后的細胞克隆形成數明顯減少（圖4），說明乙酸乙酯萃取部位抑制了A549細胞的克隆形成。10 μg/mL乙酸乙酯萃取部位組較對照組克隆形成率明顯降低，克隆形成抑制率顯著升高，克隆形成抑制率可達＞70%（P＜0.01）（表1）。

2.5 細胞周期分析 流式細胞術檢測結果見表2，10 μg/mL乙酸乙酯萃取部位作用后細胞周期與對照組的細胞相比細胞周期的分布無明顯改變（P＞0.05）。與對照組（圖5A）比較，實驗組G1期峰前出現顯著的凋亡峰（圖5B），同時實驗組凋亡細胞數比對照組顯著增加（P＜0.01），表明乙酸乙酯萃取部位能夠誘導A549細胞細胞凋亡。

2.6 Hoechst 33258染色檢測細胞凋亡 經乙酸乙酯萃取部位不同濃度作用72 h后，用Hoechst 33258染色，熒光顯微鏡結果顯示（圖6），對照組細胞所發(fā)熒光較弱，較均勻，經乙酸乙酯萃取部位處理后，細胞數量減少，出現有高亮藍色的典型凋亡小體，其細胞皺縮、細胞核固縮、碎裂、發(fā)泡、體積變小，熒光強度增高。說明乙酸乙酯萃取部位有明顯誘導A549細胞凋亡的作用。

表 1 不同濃度乙酸乙酯萃取部位處理A549細胞后克隆形成率及克隆形成抑制率的比較Tab 1 Comparion of clone-formation rate and clone-formation inhibition rate among A549 cells treated with different concentration of ethyl acetate extract

表 2 乙酸乙酯萃取部位對A549細胞周期及凋亡率的影響Tab 2 The effects of ethyl acetate extract on cell cycle and apoptotic rate of A549 cells

圖 1 麥門冬湯合千金葦莖湯8個部位對A549細胞生長的影響Fig 1 The effect of eight extracts form Maimendong & qianjinweijing tang on A549 cells growth

圖 2 乙酸乙酯萃取部位對細胞生長的影響Fig 2 The effect of ethyl acetate extract on cells growth

圖 3 不同濃度乙酸乙酯萃取部位對A549細胞增殖的影響（×200）Fig 3 Proliferative inhibition of different concentrations of ethyl acetate extract on A549 cells (×200) . A: Control group; B: 1 μg/mL ethyl acetate extract group; C: 10 μg/mL ethyl acetate extract group; D: 100 μg/mL ethyl acetate extract group.

圖 4 不同濃度乙酸乙酯萃取部位處理A549后細胞克隆形成情況Fig 4 The effect of different concentrations of ethyl acetate extract on colony formation of A549 cells. A: Control group; B: 1 μg/mL ethyl acetate extract group; C: 10 μg/mL ethyl acetate extract group; D: 100 μg/mL ethyl acetate extract group.

2.7 Western blot檢測結果 與對照組A549細胞相比，不同濃度乙酸乙酯部位處理組的細胞β-actin蛋白表達相當，而細胞的EGFR和ERK1/ERK2蛋白表達量均有下降，其中以100 μg/mL最為明顯，10 μg/mL和1 μg/mL次之（圖7），說明乙酸乙酯萃取部位能夠下調EGFR-ERK/MAPK信號轉導通路。

3 討論

肺癌是世界各國常見的惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤中增長是最快的，是目前人類癌癥死亡的主要原因，并被認為是當今世界對人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤。在我國，肺癌占惡性腫瘤發(fā)病、死亡的首位。大部分患者就診時已處于中晚期階段，現行的常規(guī)的治療手段效果不甚理想。近年來，中醫(yī)藥治療肺癌在穩(wěn)定病灶、延長生存時間、改善生存質量等方面發(fā)揮了顯著的療效，不僅單用有效，而且可與手術、放療、化療聯(lián)合運用提高臨床療效和減少毒副反應，應用廉價的

圖 5 乙酸乙酯萃取部位作用A549細胞流式細胞儀測定結果Fig 5 Apoptosis of lung cancer cell line A549 induced by ethyl acetate extract. A: Control group; B: Ethyl acetate extract group.

圖 6 不同濃度乙酸乙酯萃取部位誘導A549細胞凋亡的形態(tài)改變（×400）Fig 6 Ethyl acetate extract-induced apoptotic morphologic changes of A549 cells (×400). A: Control group; B: 1 μg/mL ethyl acetate extract group; C:10 μg/mL ethyl acetate extract group; D: 100 μg/mL ethyl acetate extract group.

圖 7 乙酸乙酯萃取部位對A549細胞凋亡相關基因表達的影響Fig 7 Effects of ethyl acetate extract on expression of apoptosisrelated genes in A549 cells

2中藥治療肺癌在臨床實踐中日益顯示出優(yōu)勢。從多靶點綜合考慮治療肺癌是我國中醫(yī)藥治療肺癌的特色之一，但中藥復方的成分復雜、整體層次研究困難，單一成分研究較容易，但又常失去中醫(yī)藥的特色。因此，對于有效部位群的藥效相關性研究就顯得尤為重要，它在中藥現代化研究中起著承前啟后的作用。

體外實驗是目前抗腫瘤藥物研究的重要方法，本研究采用人肺腺癌A549細胞為主要研究對象，對中藥復方麥門冬湯合千金葦莖湯有效部位群的體外抑癌作用進行了研究。本研究的檢測結果表明，乙酸乙酯萃取部位能有效地抑制A549細胞的增殖，并能誘導腫瘤細胞凋亡。細胞無限制快速生長是惡性腫瘤細胞的主要特征之一，從光鏡觀察及MTT細胞活力實驗證實，乙酸乙酯萃取部位對A549細胞的生長有明顯抑制作用，集落形成實驗也得出一致的結論，克隆形成率是體外抗癌藥物敏感性篩選的重要方法之一，由結果可看出乙酸乙酯萃取部位可以抑制A549細胞克隆形成能力，而克隆形成能力可反應細胞的增殖能力和群體依賴性，克隆形成率的降低說明經乙酸乙酯萃取部位干預后腫瘤細胞群中有增殖能力的干細胞比例減少，從而抑制了腫瘤細胞的增殖。在以上結果的基礎上，采用流式細胞術進一步探討乙酸乙酯萃取部位對A549細胞周期的影響，結果發(fā)現實驗組細胞在G1峰前出現了明顯凋亡峰，提示凋亡細胞數增多，這表明乙酸乙酯萃取部位能夠誘導肺腺癌A549細胞發(fā)生凋亡。細胞凋亡是基因調控的細胞自主死亡過程，主要表現為染色質凝聚，細胞核固縮，進而核碎裂形成凋亡小體。Hoechst染色細胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。本研究顯示，經乙酸乙酯萃取部位干預72 h后的各組細胞，用Hoechst 33258染色熒光顯微鏡下觀察，均能找到細胞核致密濃縮發(fā)白發(fā)亮的細胞，其細胞核染色質凝集、邊移、并發(fā)生碎裂、出現凋亡小體，證實乙酸乙酯萃取部位可以誘導A549細胞凋亡，綜合以上結果，提示乙酸乙酯萃取部位誘導細胞凋亡是其顯著抑制A549細胞增殖的重要途徑。

細胞凋亡的機制中，凋亡的細胞因子受體信號轉導途徑一直被人們所關注，目前認為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信號傳導通路的異常激活與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關[2]。細胞外信號調節(jié)激酶（extra cellular signal regulated kinase, ERK）是MAPK通路的主要成員，其Raf-MEK-ERK信號轉導通路是最具代表性的MAPK信號傳導途徑之一，也是研究的較為清楚的通路[3]，主要介導促有絲分裂和抗凋亡信號，可以通過抑制凋亡促進細胞存活，參與細胞的增殖、分化以及多種代謝功能。研究[4]發(fā)現，在肺腺癌形成早期階段ERK通路已被激活。Brognard等[5]在對19種組織分型不同的非小細胞肺癌的研究中發(fā)現，17種存在ERK通路激活現象，提示在非小細胞肺癌中ERK1/2有促進細胞生存和產生化療耐藥的作用。在轉移方面，ERK1/2的激活除了能促進血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的表達，引起血管生成，促進肺癌的遠處轉移[6]，還參與由糖蛋白聚集素（clusterin, CLU）調節(jié)的上皮細胞向間質細胞轉變（mesenchymal-to-epithelial transition, MET）和肺腺癌的惡性行為[7]。由此可見，ERK蛋白的過表達在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移過程中起著重要的促進作用。其主要的作用機制為細胞外生長因子（EGF或TGF-α）與膜受體EGFR結合引起受體二聚化，氨基酸殘基磷酸化，從而激活細胞膜內側的Ras-Raf通路，活化的Ras-Raf可進一步激活MEK-ERK通路，后者進入細胞核作用與c-Jun、c-Fos等多種轉錄因子，導致細胞增殖或分化。ERK是Ras/Raf/MEK/ERK通路上與細胞核最為靠近的成員，ERK1與ERK2蛋白有90%相同的氨基酸序列，并在體外有相同的作用底物，二者有功能上的重疊。本研究結果顯示，乙酸乙酯萃取部位作用于A549細胞后，引起ERK1/ERK2表達下調，說明其激酶活性下降，同時引起上游信號EGFR表達降低，提示EGFR-ERK/MAPK信號通路是乙酸乙酯萃取部位作用靶點之一。

綜上所述，本實驗證明乙酸乙酯萃取部位在抑制A549細胞增殖的同時使細胞趨于凋亡，其作用機理與ERK信號轉導途徑密切相關，而乙酸乙酯萃取部位作為細胞外信號分子，作用于細胞后，其受體和信號轉導的過程，以及如何啟動細胞凋亡基因表達是值得我們進一步研究的課題。因此，對有效部位群及化合物作用肺癌信號轉導通路及相關機制的研究值得進一步探討，同時為豐富中醫(yī)經典復方有效作用機制提供科學依據。