制備兩種p53重組腺病毒和流式細胞儀定量外源綠熒光蛋白表達

汪惠 賴百塘 李偉英 楊學惠 張春燕 韋攀健 李金照

我們在體外研究中發現去除C-末端負調控區的p53比全長p53在體外抑制人肺癌細胞的增殖作用更強[1]。為了進一步深人研究去除p53 C-末端的生物學意義，該研究采用5型缺陷型腺病毒pAdEasy-Track載體系統[2]，構建和制備了去C-末端p53和全長p53重組腺病毒，命名為Adp53(del)和Ad-p53(wtp)。質粒Track上有2個CMV啟動子，可分別啟動下游綠熒光蛋白（green fluorescence protein,GFP）基因和重組基因表達。GFP在細胞中表達可作為病毒感染和轉導外源基因效果的標記。通常，用熒光顯微鏡檢測細胞GFP表達，但方法不夠準確。該研究用流式細胞儀散點圖（flow cytometry scatter plot, FCM）可量化表達GFP細胞的百分率，為確定該病毒試驗系統的可靠性和病毒感染人肺癌細胞濃度提供準確方法。

1 材料與方法

1.1 細胞系 人大細胞肺癌細胞系801D，由中國人民解放軍301醫院提供。

1.2 缺陷型重組腺病毒的制備 按Tong-Chuan He[2]報告pAdEasy-Track載體系統和方法構建。

1.2.1 構建兩種類型p53重組質粒Track-p53(del)和Trackp53(wtp) pAdEasy-N1（5型缺陷型腺病毒骨架）和Track由北京腫瘤研究所張志謙教授提供。用BamH1酶切重組質粒pEGFP-N1-p53(del) cDNA和PEGFP-N1-p53(wtp)cDNA獲去C-末端p53和全長p53片段。經質粒Track多克隆位點BigII（BamH1同位酶）插入構建重組質粒，轉染大腸菌E.coli，卡那霉素篩選耐受菌落。提DNA經Awlnl和Hindi雙酶切重組質粒，酶切圖篩選。

1.2.2 在細菌中產生同源重組體 pAdT-Ep53(del)、pAdT-Ep53(wtp)、pAdT-E。用酶pac1消化Track、Trackp53(del)、Track-p53(wtp)成線性，分別與pac1消化的pAdEasy-N1混合，用電轉移方法轉染大腸感受態桿菌（E.coli BJ5183株），Track和pAdEasy-N1在細菌中同源重組，kanamycin篩選耐受菌，挑選瓊脂培養基上的集落擴增，提取DNA，經瓊脂電泳分析DNA，選擇超螺旋構象重組體，并進一步用pac1酶切圖證明。經Xho1、EcoR1酶切圖篩選三種重組體。

1.2.3 在293包裝細胞中制備缺陷型重組腺病毒 Adp53(del)、Ad-p53(wtp)、Ad-(empty carrier)。接種293細胞（1.5×105/3 cm平皿），lipofectamin分別轉染三種同源重組體，熒光顯微鏡監測細胞中GFP表達。7 d-10 d收集細胞和上清，凍存，制備缺陷型腺病毒。

1.2.4 重組質粒、同源重組體、重組腺病毒DNA測序重組質粒：Track-p53(wtp)、Track-p53(del)，同源重組體：AdT-Ep53(del)、pAdT-Ep53(wtp)、pAdT-E，重組腺病毒；Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)、Ad-(empty carrier)提DNA由上海生工測序，經Gene Bank公共數據庫比對（blast）。

1.2.5 病毒濃度（multiplicity of infection）測定[2]接種293包裝細胞（5×106/3 cm/平皿），取病毒原液稀釋10倍后分別取0.75 μL、1.5 μL、3 μL、6 μL、12.5 μL、25 μL感染細胞，3 d后，FCM檢測801D細胞GFP表達。按下列公式計算每微升原液病毒的數量。

病毒原液最小體積是指上述稀釋病毒液感染細胞平皿中90%以上293細胞表達GFP所加入最少的病毒體積。接種293細胞數×10是指接種的細胞中每個細胞約含有10倍病毒。

1.2.6 病毒感染人肺癌細胞在裸鼠體內表達 接種2×106801D細胞，分別用于細胞50倍的三種重組腺病毒感染細胞接種裸鼠皮下，24 h后，取接種部位細胞團壓片，于熒光顯微鏡檢測細胞GFP。

1.3 熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測體外感染細胞GFP表達

1.3.1 病毒感染801D細胞：制備 3×105801D細胞懸液，稀釋10倍后，分別用細胞的25、50、100、200倍3種病毒感染細胞，3 h后接種于平皿（3 cm）。37oC、CO2暖箱培養24 h。行熒光顯微鏡檢測，同時消化，洗滌，稀釋細胞，行FCM檢測細胞。

1.3.2 熒光顯微鏡（激發光為488 nm，發射光波長為507 nm濾光片）檢測細胞GFP表達。

1.3.3 FCM scatter plot（激發光為488 nm）檢測細胞GFP表達。R6為無GFP表達細胞比率，R2、R3、R4、R5為表達GFP細胞和不同GFP熒光強度細胞的百分率（從弱到強）。

2 結果

2.1 去除C未端p53和全長p53重組質粒的構建 構建去C-末端p53和全長p53重組質粒Track-p53(del)和Trackp53(wtp)，經Awlnl和Hind酶切圖篩選。

2.2 重組質粒與pAdEasy-N1在細菌中產生同源重組體DNA瓊脂電泳構像不同，選擇重組體（圖1）。由于Track上有兩個pac1酶切點，Easy上有一個酶切點，用pac1酶切重組體，可產生一個30 kb大片段和約3 kb-4 kb小片段（圖2）。經Xho1、EcoR1酶切圖篩選Track-Eazyp53(del)、Track-Easy-p53(wtp)和Track-Easy（圖3）。

2.3 三種重組腺病毒制備 在L293細胞中制備了三種重組腺病毒：Ad-(empty carrier)、Ad-p53(del)和 Adp53(wtp)。可見細胞中GFP表達（圖4）。

2.4 測序結果（圖5） 兩種重組質粒測序，經Gene Bank公共數據庫blast證明Track-p53(wtp)無堿基缺失（圖5A）。Track-p53(del)在p53終止密碼子TGA前有111個堿基缺失和終止密碼子后的所有非編碼序列缺失（圖5B）。三種同源重組體（圖5C、D、E）和三種p53重組腺病毒（圖5F、G、H）測序結果經blast證明p53序列與重組質粒Track-p53(del)和Track-p53(wtp)結果相同。Track-Easy、Ad-(empty carrier)無p53序列。

2.5 病毒濃度 FCM scatter plot顯示90%以上L293細胞表達GFP，最小病毒感染細胞濃度：Ad-(empty carrier)、Adp53(wtp)為1.5 μL和Ad-p53(del)為3 μL（表1）。按上述M0i公式計算A、C病毒濃度為3.7×1010/mL，B病毒為1.6×1010/mL。

2.6 三種重組腺病毒感染人肺癌801D細胞GFP表達結果

2.6.1 病毒感染的801D細胞接種裸鼠體內24 h后細胞GFP開始表達（圖6）。

2.6.2 熒光顯微鏡下觀察801D GFP表達 25、50、100、200倍三種病毒感染的801D細胞在熒光顯微鏡下觀察到細胞GFP表達（圖7）。對照細胞（無感染病毒的801D）無GFP表達。感染的801D細胞隨病毒濃度增加，表達GFP細胞的數量增加。細胞中有不同熒光強度細胞，隨病毒濃度增加，細胞熒光強度增加。同一濃度不同種類病毒GFP表達結果相近。但不能準確估計各病毒濃度對細胞的感染率。

2.6.3 FCM scatter plot檢測結果 結果顯示對照細胞（無感染病毒的801D）99.9%無GFP表達（R6）（圖8D）。三種病毒感染的細胞均表達GFP（R2-R5）（圖8A、B、C；表2）。隨病毒濃度增加，細胞GFP表達率增加。Ad-p53(wtp)病毒感染（圖8A）：25倍有47%細胞表達GFP。50倍有68%。100倍有79%。200倍有95%。Adp53(del)病毒（圖8B）：25倍有37%細胞表達GFP，50倍有71%，100倍有74%，200倍為90%。Ad-(empty carrier)病毒感染801D（圖8C）：25倍感染有46%細胞表達GFP，50倍有62%，100倍有79%，200倍有94%。同一濃度不同病毒感染細胞表達GFP細胞的比率相近。此外，FCM scatter plot還顯示了三種病毒感染的801D細胞群體中包含了表達不同熒光強度（R2、R3、R4、R5）細胞的百分率（表3，圖9）。表達低熒光強度（R2）細胞約占9%，不隨病毒濃度增加，主要分布在低濃度感染的細胞。表達中等熒光強度（R3）的細胞比率最高，約占28%。細胞比率不隨病毒濃度增加而改變。高熒光強度（R4、R5）細胞分別約占20%、13%，主要分布在高濃度病毒（100倍、200倍）感染的細胞。提示801D由表達不同GFP強度的細胞組成。

圖 1 不同集落DNA在瓊脂電泳上構象選擇同源重組體。5號為超螺旋同源重組體。Fig 1 DNA conformation of different clone on agarose gel electroporator to select homologous recombinants. The number 5 is homologous recombinant of supercoiled form.

圖 2 Pac1酶切圖證明重組體Fig 2 Pac1 restrictive endonuclease map of two p53 recombinants.1: Track; 2: Easy; 3: T-E-p53(wtp); 4: 5.T-E-p53(del); 6: marker(λ-HindIII).

圖 3 Xho1、HindIII酶切圖證明兩種重組p53Fig 3 Xho1, HindIII restrictive endonuclease map of two p53 recombinants. 1: T-Ep53(wtp); 2: T-Ep53(del); 3, 4: T-E; 5: Marker(λ-HindIII).

圖 4 L293細胞系中產生重組腺病毒Fig 4 Generation of pAdEasy-p53(del) in L293 cell line

表 1 流式細胞儀檢測L293細胞GFP表達Tab 1 Detection GFP expression on L293 cells by FCM

3 討論

圖 6 轉染Ad-p53(del)病毒的細胞在裸鼠體內表達GFPFig 6 GFP expression of cells infected by Ad-p53(del) in vivo

圖 7 熒光顯微鏡檢測不同濃度Ad-p53(del)病毒感染 801D細胞GFP表達。50x（A），100x（B），200x（C）：轉染細胞的病毒濃度。Fig 7 Detection GFP expression by fluorescent microscopy in 801D cells infected with different density Ad-p53(del). 50x (A), 100x (B), 200x (C):different virus density to infect cells.

表 2 流式散點圖檢測不同病毒感染801D細胞表達GFP百分率Tab 2 Detection of percentage of 801D cell GFP-expressed by FCM scatter plot

表 3 流式散點圖顯示表達不同熒光強度細胞分布Tab 3 FCM scatter plot detection of distribution of fluorescent intensity in 801D cells infected with different viruses

圖 8 FCM scatter plot檢測801D細胞GFP表達。A：Ad-p53(wtp)轉染801D細胞GFP表達；B：Ad-p53(del)轉染801D細胞GFP表達；C：Ad-(empty carrier)轉染801D細胞GFP表達；D：無轉染801D。Fig 8 Detection GFP expression in cells infected-viruses by FCM scatter plot. A: GFP expression in cells infected-Ad-p53(wtp); B: GFP expression in cells infected-Ad-p53(del); C: GFP expression in cells infected-Ad-(empty carrier); D: Without GFP expression in control 801D cells.

圖 9 流式顯示表達不同熒光強度細胞的分布Fig 9 FCM scatter plot indicate GFP distribution to cells infected by Adp53(wtp) (A), Ad-p53(del) (B) and Ad-(empty carrier) (C)

抑癌基因p53作為轉錄因子在細胞應激時呈活化狀態，通過調節細胞增殖周期和細胞程序性死亡抑制腫瘤生長，通常處于非活化型，通過各種機制包括p53 C-末端負調控區的作用所致[3-5]。先前，我們利用轉基因細胞在體外試驗中已證明了外源去C-末端p53比全長p53抑制人肺癌細胞801D的增殖作用更強。并發現可增加對抗腫瘤藥物敏感性（尚未發表）。重組腺病毒是研究外源基因表達及生物學功能和基因治療的重要載體[6]。該文報告了采用pAdEasy-Track載體系統構建和制備了去C-末端p53和全長p53兩種重組腺病毒Ad-p53(del)、Ad-p53(wtp)以及空載體Ad-(empty carrier)。該載體系統可快速大量產生重組腺病毒為進一步深人研究p53 C-末端負調節功能提供了條件。病毒轉導外源基因的效果是進行研究的必要前提。由于病毒、細胞、感染方法和實驗條件等諸多因素可影響到病毒載體對細胞感染和轉基因效果，因此建立精確檢測轉導基因效果的方法用于估價所建立的病毒試驗系統的可靠性和準確性是重要的。通常，通過重組質粒上的標記基因表達作為病毒感染細胞和轉基因的標記。該研究所用質粒Ad Track上有2個CMV啟動子，分別起動GFP標記基因和外源基因表達。通常用熒光顯微鏡檢測細胞GFP表達，但結果不夠精確。用FCM檢測可精確顯示GFP表達[7,8]。本研究采用FCM檢測L293細胞GFP表達可精確確定重組腺病毒的濃度。在分別用25、50、100、200倍重組腺病毒感染人肺癌801D細胞后，用熒光顯微鏡和FCM兩種方法檢測細胞。結果顯示熒光顯微鏡觀測可見表達GFP細胞隨病毒濃度遞增，三種病毒感染細胞表達GFP效果比較接近。并可見表達GFP細胞群體中包含了表達不同熒光強度的細胞。但不能準確估計表達GFP細胞比率。FCM scatter plot能夠準確顯示感染細胞GFP表達百分率。隨病毒濃度遞增。不同病毒相同濃度感染，細胞GFP表達百分率接近。結果為選擇病毒感染細胞的合適濃度做了提示。此外，scatter plot顯示801D細胞群體中包含了4種不同熒光強度比率的細胞。表達低熒光強度（R2）細胞約占9%，不隨病毒濃度增加。表達中等熒光強度（R3）的細胞比率最高，約占28%，病毒濃度增加，細胞比率無明顯改變。高熒光強度（R4、R5）細胞分別約占20%、13%，主要分布在高濃度病毒（100倍、200倍）感染的細胞。探其緣由可能與腫瘤細胞表面的病毒特異性科薩奇腺病毒受體（coxsackie and adenovirus receptor,CAR）以及整合素（integrin）的表達水平不同有關。在腺病毒對腫瘤細胞的感染和轉導外源基因表達中它們起著決定性作用[9]。801D存在表達特異性表面受體和整合素水平不同的細胞是腫瘤細胞異質性的表現[10]。該結果提示針對不同腫瘤患者采用不同濃度的重組腺病毒進行基因治療可能更有利于患者治療。總之，FCM scatter plot檢測所顯示的優點是重組腺病毒載體轉導外源基因生物學實驗和重組腺病毒為載體的臨床基因治療中值得推崇的方法。

本研究采用pAdEasy-Track載體系統成功構建和制備了去C-末端p53和全長p53兩種重組腺病毒：Adp53(del)、Ad-p53(wtp)以及空載體Ad-(empty carrier)。FCM scatter plot定量顯示感染細胞中表達外源GFP細胞百分率和表達不同熒光強度細胞的百分率，證明了該病毒試驗系統可靠性和為選擇病毒感染人肺癌細胞801D的合適濃度提供準確方法。