核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ENT3單核苷酸多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系

李雪飛 張頡 張?jiān)隼?周彩存

過(guò)去20年間，中國(guó)肺癌的發(fā)病率和死亡率均在顯著增加。研究[1]表明吸煙是肺癌的主要危險(xiǎn)因素之一。然而，只有一部分暴露個(gè)體會(huì)罹患肺癌，這說(shuō)明個(gè)體的遺傳背景可能與肺癌的易感性有關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)很多基因如DNA修復(fù)基因、原癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因等，它們的遺傳變異或單核苷酸多態(tài)性均與肺癌易感性相關(guān)。

平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類(lèi)膜內(nèi)在蛋白，根據(jù)濃度梯度完成核苷及其類(lèi)似物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。目前該家族有4個(gè)成員：ENT1-4。核苷作為體內(nèi)重要的低分子化合物具有很多重要功能。除了參與RNA和DNA的合成之外，它們還參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等諸多重要生理功能[2]。而由核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所介導(dǎo)的核苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用，同時(shí)對(duì)于核苷酸的從頭合成也是極其重要的。另外核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也是核苷類(lèi)似物抗腫瘤或抗病毒藥物吸收的關(guān)鍵因素，可能影響藥物療效。已有文獻(xiàn)[3]報(bào)道，這一家族成員SLC29A1即ENT1是結(jié)直腸癌的候選易感基因。另外，Yamamoto等[4]報(bào)道ENT3多態(tài)位點(diǎn)rs10999776（C＞T）與晚期非小細(xì)胞肺癌（non small cell lung cancer, NSCLC）一線化療后的總體生存時(shí)間具有相關(guān)性。然而，ENT3基因的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）是否與肺癌易感性具有相關(guān)性尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)病例-對(duì)照研究，探討中國(guó)漢族人群ENT3多態(tài)位點(diǎn)rs10999776（C＞T）與肺癌易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 351例肺癌患者為2008年5月-2009年5月在上海市肺科醫(yī)院診斷并經(jīng)病理確診的原發(fā)性肺癌初診患者，未經(jīng)過(guò)任何抗癌治療，無(wú)職業(yè)性致癌因素接觸史，均為漢族人群。病理類(lèi)型按WHO《肺腫瘤組織學(xué)分型》（2000）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類(lèi)，其中腺癌192例，鱗癌100例，混合癌31例（腺鱗混合癌、腺癌大細(xì)胞混合癌、鱗癌小細(xì)胞混合癌、低分化癌），未分類(lèi)28例。207例對(duì)照為上海市肺科醫(yī)院同期住院的非腫瘤患者。研究個(gè)體之間無(wú)血緣關(guān)系。每天至少吸1支，連續(xù)吸煙1年或以上者定義為吸煙個(gè)體。包/年=（每日吸煙支數(shù)÷20支）×吸煙年數(shù)。

1.2 DNA提取和資料收集 所有研究對(duì)象均采集外周靜脈血5 mL，應(yīng)用外周血DNA抽提試劑盒（上海超世生物）抽提基因組DNA，具體方法按說(shuō)明書(shū)操作。經(jīng)Elution buffer溶解的基因組DNA置于-20oC冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ醒芯總€(gè)體均簽署了知情同意書(shū)。

1.3 ENT3 rs10999776多態(tài)性檢測(cè)

1.3.1 引物及探針合成 引物及探針均由上海市超世生物技術(shù)有限公司合成。序列如下：上游引物5'-GC CAAGAACAAAACAGTGAGC-3'，下游引物5'-CAAG GAATGGCCAGGAGAA-3'；AllGloTM野生型探針MARTTCCTACCCCGGAGAGA-MAR，突變型探針MARTCTTCTCTCCAGGGT-MAR。AllGloTM探針為新一代熒光探針（專利號(hào)：60/23263），兩端均標(biāo)記MAR熒光基團(tuán)，兩者互為報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，大大提高了熒光增量，同時(shí)因?yàn)槿玖仙虾锌梢蕴岣逿m值的基團(tuán)，也使探針的特異性大大提高。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 反應(yīng)體系為20 μL，其中Mix buffer 10 μL，上下游引物各250 nmol/L，模板DNA 100μL，Taq-DNA聚合酶1 U。每個(gè)樣品分別在2個(gè)毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，每管分別含有250 nmol/L的野生型探針和突變型探針。反應(yīng)條件：95oC預(yù)變性15 s，95oC、10 s，58oC、40 s，45個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光PCR儀Lightcycler 3.0購(gòu)自德國(guó)羅氏公司。

1.3.3 結(jié)果判斷 實(shí)時(shí)PCR產(chǎn)物為85 bp。探針利用與靶序列特異性雜交以顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。在探針與靶序列配對(duì)時(shí)，兩端的熒光基團(tuán)互為淬滅基團(tuán)無(wú)熒光信號(hào)發(fā)出，當(dāng)延伸進(jìn)行時(shí)，DNA聚合酶5'外切酶活性使得2個(gè)熒光基團(tuán)分離而同為報(bào)告基團(tuán)，從而檢測(cè)到熒光信號(hào)。每個(gè)樣本在2個(gè)分別含有野生型和突變型探針的毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，若在含有野生型探針的毛細(xì)管內(nèi)發(fā)生了延伸反應(yīng)，檢測(cè)到呈S形曲線的熒光信號(hào)，而在另一毛細(xì)管內(nèi)無(wú)反應(yīng)，則該樣本為野生型純合子（CC）；反之，則為突變型純合子（TT）。若兩管均發(fā)生延伸反應(yīng)，產(chǎn)生S形曲線，則樣本為雜合子（TC）。然后隨機(jī)抽取個(gè)別樣本進(jìn)行DNA測(cè)序檢測(cè)，以驗(yàn)證探針?lè)磻?yīng)的準(zhǔn)確性，測(cè)序工作由上海超世生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有資料應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)分析對(duì)照組rs10999776多態(tài)位點(diǎn)基因型分布的Hardy-Weinberg平衡。肺癌組和對(duì)照組的基因型及等位基因分布比較采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用非條件Logistic回歸模型計(jì)算相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度的比值比（odds ratio, OR）及95%CI，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果和分析

2.1 肺癌組與對(duì)照組的基本情況 如表1所示，肺癌組和對(duì)照組的性別和年齡構(gòu)成無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。肺癌組吸煙個(gè)體比例（56.1%）顯著高于對(duì)照組（46.4%）（χ2=4.962, P=0.026）。累積吸煙量（包/年）肺癌組與對(duì)照組比較也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=10.692, P=0.001）。

2.2 ENT3 rs10999776的多態(tài)性分布 所有DNA標(biāo)本均經(jīng)AllGloTM探針成功分型，DNA測(cè)序結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果一致。如圖1所示：A和B為實(shí)時(shí)熒光PCR的S形曲線，其中A表示野生型探針發(fā)生反應(yīng)，而突變型探針未反應(yīng)，故該樣本基因型為野生型純合子CC；而B(niǎo)則表示突變型探針發(fā)生反應(yīng)，而野生型探針未反應(yīng)，樣本為突變型純合子TT。C和D則分別為與上述樣本相對(duì)應(yīng)的DNA測(cè)序結(jié)果，兩者一致。對(duì)照組ENT3 rs10999776（C＞T）的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.674,P=0.714）。對(duì)照組中ENT3 rs10999776（C＞T）3種基因型（CC、TC、TT）頻率分別為58.4%、37.7%、3.9%，C和T等位基因頻率分別為77.3%、22.7%；肺癌組中3種基因型（CC、TC、TT）頻率分別為52.4%、41.6%和6.0%，C和T等位基因頻率分別為73.2%和26.8%，兩組之間基因型和等位基因分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2分別為2.488、2.290，P值分別為0.288、0.130），見(jiàn)表2。

2.3 ENT3 rs10999776多態(tài)性與吸煙聯(lián)合作用對(duì)肺癌風(fēng)險(xiǎn)性的影響 以攜帶野生基因型CC且非吸煙者為參照，累積吸煙量≥30包/年的野生基因型攜帶者患肺癌風(fēng)險(xiǎn)性增高，調(diào)整OR值為2.305（95%CI: 1.337-3.854, P=0.037）；而攜帶突變等位基因T的TC和TT基因型吸煙個(gè)體罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)性更高，且≥30包/年者更甚，調(diào)整OR值分別為2.848（95%CI: 1.536-4.879, P=0.005）和3.076（95%CI:2.308-6.741, P=0.001），見(jiàn)表3。

2.4 ENT3 rs10999776多態(tài)性與吸煙聯(lián)合作用對(duì)肺癌不同病理類(lèi)型的影響 以攜帶野生基因型CC且非吸煙者為參照，發(fā)現(xiàn)3種基因型的吸煙個(gè)體罹患肺鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)性均顯著增高，但攜帶突變等位基因T的吸煙個(gè)體其風(fēng)險(xiǎn)性要高于野生型純合子吸煙個(gè)體，OR值分別為6.066（95%CI:2.884-12.758, P＜0.001）和2.573（95%CI: 1.238-5.348,P=0.01）。在野生型純合子和攜帶突變等位基因T的個(gè)體中，吸煙≥30包/年者罹患肺鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)性均更高，OR值分別為4.456（95%CI: 2.016-9.850, P＜0.001）和8.077（95%CI: 3.581-18.215, P＜0.001）；而三種基因型聯(lián)合吸煙對(duì)肺腺癌的風(fēng)險(xiǎn)性并無(wú)明顯影響（表4）。

3 討論

SNP作為人類(lèi)最常見(jiàn)的DNA遺傳變異，最早只被作為一種基因組作圖的遺傳標(biāo)記，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)很多基因的SNP能夠影響基因功能，與疾病易感性、藥物療效等相關(guān)，而日益引起研究者們的重視[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多基因的SNP與肺癌易感性相關(guān)，如XRCC1、SULT1A1等[6,7]。

表 1 肺癌組和對(duì)照組一般情況與吸煙情況比較Tab 1 The comparison of general condition and smoking situation between lung cancer and control group

表 2 肺癌組和對(duì)照組基因型與等位基因分布Tab 2 The distribution of genotypes and alleles in groups of lung cancer and control

圖 1 AllGloTM探針檢測(cè)的基因型結(jié)果與DNA測(cè)序驗(yàn)證Fig 1 The genotype from AllGloTM probe assay and sequencing verification. A and B respectively denote real-time fluorescence curves of homozygous wild-type CC and homozygous mutation-type TT by AllGloTM probe assay; C and D show sequencing results corresponding with PCR. The arrows indicate allele.

核苷作為體內(nèi)重要的低分子化合物，具有重要的生物學(xué)功能，如內(nèi)源性核苷參與調(diào)節(jié)血液流動(dòng)、糖代謝等重要生理功能。而核苷在細(xì)胞內(nèi)的濃度將影響其功能的發(fā)揮。核苷的代謝和運(yùn)輸是影響核苷濃度水平的關(guān)鍵因素。而負(fù)責(zé)核苷跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白十分重要。哺乳動(dòng)物細(xì)胞主要有兩大類(lèi)核苷轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)：平衡型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（the equilibrative transport system, ENT）和集中型轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（the concentrative transport system, CNT）[8,9]。前者是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)外核苷的濃度梯度進(jìn)行跨膜運(yùn)輸，有4個(gè)家族成員ENT1-4，分布廣泛；后者則是鈉離子偶聯(lián)性的而與濃度梯度無(wú)關(guān)，有6個(gè)家族成員。目前，對(duì)ENT1的研究較多，Sjoblom等[3]認(rèn)為ENT1的遺傳突變與結(jié)直腸癌的易感性有關(guān)，還有一些研究[10,11]是集中于ENT1多態(tài)性或表達(dá)水平對(duì)核苷類(lèi)似物抗腫瘤藥如2,2-二氟脫氧胞嘧啶核苷等療效的影響。而對(duì)ENT3的報(bào)道并不多。Yamamoto等[4]分析了219個(gè)基因的5 438個(gè)SNPs位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)位于ENT3基因第二內(nèi)含子上的多態(tài)位點(diǎn)rs10999776與晚期肺癌一線化療的預(yù)后有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，ENT3 rs10999776（C＞T）的CC、TC、TT基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.674,P=0.714）。肺癌組和對(duì)照組之間的基因型和等位基因分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=2.488, P=0.288; χ2=2.290, P=0.130）。

吸煙是肺癌的主要致癌因素，本研究將基因型與吸煙聯(lián)合分析，結(jié)果顯示累積吸煙量≥30包/年的野生型純合子個(gè)體罹患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)性增加；而攜帶突變等位基因T的吸煙個(gè)體患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)性更高，調(diào)整OR值分別為2.305（95%CI: 1.337-3.854, P=0.037）和2.848（95%CI:1.536-4.879, P=0.005）。累積吸煙量≥30包/年的T等位基因攜帶者其風(fēng)險(xiǎn)性又進(jìn)一步提高，OR值為3.076（95%CI:2.308-6.741, P=0.001）。這些結(jié)果提示突變等位基因T聯(lián)合吸煙對(duì)肺癌風(fēng)險(xiǎn)性具有一定貢獻(xiàn)作用。

肺癌分為不同的病理類(lèi)型，它們的病因、組織發(fā)生、生物學(xué)特性等均各不相同。而在對(duì)該位點(diǎn)3種基因型聯(lián)合吸煙與肺癌病理類(lèi)型的分析發(fā)現(xiàn)：與非吸煙的野生型純合子個(gè)體比較，該位點(diǎn)3種基因型的吸煙個(gè)體均有較高的罹患肺鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)。而攜帶突變等位基因T的吸煙個(gè)體要比野生型吸煙個(gè)體的風(fēng)險(xiǎn)性更高，患病風(fēng)險(xiǎn)分別增加了6倍和2倍。累積吸煙量≥30包/年的個(gè)體，CC純合子和TC+TT攜帶者的患病風(fēng)險(xiǎn)則分別增加了4倍和8倍。而基因型聯(lián)合吸煙對(duì)肺腺癌無(wú)明顯影響。這些結(jié)果提示ENT3 rs10999776的3種基因型和吸煙聯(lián)合作用可能參與調(diào)節(jié)肺鱗癌的易感性。雖然該多態(tài)位點(diǎn)位于內(nèi)含子，并未引起氨基酸殘基的改變，但并不能排除它可能影響剪切位點(diǎn)的活性從而影響基因轉(zhuǎn)錄，或者該位點(diǎn)與其它功能位點(diǎn)存在連鎖不平衡。這些相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步的深入研究加以確認(rèn)。由于ENT3是一種核苷運(yùn)載體，其功能主要是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的核苷或核苷類(lèi)似物的濃度，進(jìn)而影響到細(xì)胞的功能。但是它與吸煙之間的關(guān)系我們推測(cè)該基因可能與其它煙草代謝相關(guān)基因存在某些相互作用。這也需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

表 3 ENT3 rs10999776多態(tài)位點(diǎn)基因型聯(lián)合吸煙與肺癌風(fēng)險(xiǎn)性的關(guān)系Tab 3 The relationship between the genotypes of rs10999776 combined with smoking and the risk of lung cancer

表 4 ENT3 rs10999776多態(tài)位點(diǎn)基因型聯(lián)合吸煙與肺癌不同病理類(lèi)型的關(guān)系Tab 4 The relationship between the genotypes of rs10999776 combined with smoking and the pathologic types of lung cancer

本研究首次對(duì)核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ENT3的單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)人群肺癌易感性的關(guān)系進(jìn)行了初步探討。ENT3 rs10999776遺傳多態(tài)性聯(lián)合吸煙可能對(duì)肺癌易感性產(chǎn)生影響，并且可能與吸煙劑量相關(guān)。但是，由于腫瘤的復(fù)雜性，任何單一基因或多態(tài)位點(diǎn)的變化均不能完全說(shuō)明和解決問(wèn)題，該遺傳多態(tài)性對(duì)肺癌易感性的影響只是對(duì)基因遺傳多態(tài)性與肺癌易感性的一個(gè)補(bǔ)充，需要挖掘更多的肺癌易感性相關(guān)基因和多態(tài)位點(diǎn)以及它們與環(huán)境暴露的相互作用，才能更有效地說(shuō)明問(wèn)題。