帕金森病模型大鼠行為學(xué)改變與黒質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元存活率之間的相關(guān)性

劉麗敏，李博，孫作厘，賈軍，汪璇，王曉民

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100069)

研究報告

帕金森病模型大鼠行為學(xué)改變與黒質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元存活率之間的相關(guān)性

劉麗敏，李博，孫作厘，賈軍，汪璇，王曉民

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)系，教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京 100069)

目的探討線刀損毀內(nèi)側(cè)前腦束建立的帕金森病模型大鼠行為學(xué)改變與黒質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元存活率之間的相關(guān)性。方法采用可伸縮線刀切斷大鼠內(nèi)側(cè)前腦束建立單側(cè)損傷的帕金森病大鼠模型;皮下注射阿樸嗎啡后測試大鼠的旋轉(zhuǎn)行為;取中腦黑質(zhì)切片進行酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)染色，通過計數(shù)黑質(zhì)致密部酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元的數(shù)目得到多巴胺能神經(jīng)元存活率。結(jié)果模型組大鼠損傷側(cè)酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元的數(shù)目明顯下降，而由阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為明顯增加。結(jié)論線刀損毀術(shù)后4周，帕金森病模型大鼠由阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為和黒質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元存活率之間存在著明顯的負相關(guān)。

帕金森病;內(nèi)側(cè)前腦束;阿樸嗎啡;多巴胺能神經(jīng)元

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是繼阿爾茨海默病后第二大常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病理改變?yōu)楹谫|(zhì)致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的漸進性死亡，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA含量降低，當(dāng)DA含量減少到正常值的10%～30%時，即出現(xiàn)以靜止性震顫、運動遲緩、肌肉僵直為特征的臨床癥狀［1］。過去的二十年中，盡管臨床實驗以及在體和離體動物實驗使PD的病因?qū)W和病理學(xué)的研究取得了很大進展，但是PD發(fā)生的分子和細胞學(xué)機制仍然不是很清楚，因此研究者們?nèi)匀恍枰蕾噭游锬Ｐ蛯ζ洳∫驅(qū)W和病理學(xué)進行研究。在本實驗中我們采用機械切斷單側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束(medial forebrain bundle，MFB)的方法建立PD大鼠模型，研究PD模型大鼠由阿樸嗎啡(apomorphine，APO)誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為和黒質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元存活率之間的關(guān)系，以期為判斷PD的病情進展及各種治療方法的療效等研究提供客觀依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:健康Wistar雄性大鼠(SPF級)，體質(zhì)量220～240 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供【SCXK(軍)2007－004】，無菌手術(shù)在首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)部屏障動物實驗設(shè)施進行【SYXK(京)2005－0022】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑:水合氯醛(北京化學(xué)試劑公司);阿樸嗎啡，小鼠單克隆抗TH抗體(Sigma公司); ABC－4002免疫組化試劑盒，ZLI9032 DAB顯色試劑(北京中杉金橋技術(shù)有限公司)。其他常規(guī)試劑主要為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器:大鼠腦立體定位儀，可伸縮線刀(美國KOPF公司);大鼠旋轉(zhuǎn)行為記錄儀(美國Columbus Instruments);冰凍切片機(德國Leica公司);普通光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 實驗方法

健康成年雄性W istar大鼠50只，隨機分為Sham(假手術(shù)對照)組和PD模型組。兩組大鼠于術(shù)后第4周末檢測由APO誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為，行為學(xué)檢測結(jié)束后2 d，經(jīng)左心室灌流固定，取腦組織冰凍切片，進行酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)免疫組化染色，計數(shù)黒質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元的數(shù)量。模型組選取向未損傷側(cè)凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)大于40 r/ 30 min的大鼠，將其旋轉(zhuǎn)圈數(shù)與黒質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元存活率之間做相關(guān)性分析。

1.2.1 大鼠腦立體定位手術(shù):大鼠腹腔內(nèi)注射6%的水合氯醛將其麻醉(350 mg/kg，i.p.)，俯臥位固定于腦立體定位儀上。消毒皮膚，暴露顱骨，調(diào)整門齒桿，使前、后囟位于同一水平面。在前囟后3.8 mm、矢狀線右側(cè)旁2.4 mm處，用牙科鉆鉆透顱骨，然后緩慢地將Scoutern線刀套管進到硬膜下8.0 mm，旋動旋鈕，將線刀從針管中伸出2.0 mm，然后將線刀上移3.0 mm，再回到原處，重復(fù)2次，緩慢收刀，退出套管，縫合皮膚。

1.2.2 旋轉(zhuǎn)行為測試方法:先給大鼠穿上束縛套后置于旋轉(zhuǎn)行為測試儀中適應(yīng)約5 m in，待大鼠安靜后皮下注射APO(0.5 mg/kg)，給藥5 m in后由旋轉(zhuǎn)行為測試儀開始統(tǒng)一記錄，設(shè)定測轉(zhuǎn)時間為30 m in。旋轉(zhuǎn)行為的表示方法:以向左側(cè)(非損傷側(cè))旋轉(zhuǎn)與向右側(cè)(損傷側(cè))旋轉(zhuǎn)總轉(zhuǎn)數(shù)的差值為凈旋轉(zhuǎn)次數(shù)。測試時注意保持測試環(huán)境安靜與黑暗。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色:于大鼠腹腔內(nèi)注射10%的水合氯醛將其深麻醉，剖開胸腔暴露心臟，經(jīng)左主動脈灌流150 m L 37℃的生理鹽水，隨后灌流200 m L冰冷的4%多聚甲醛。打開顱骨取出全腦，置于4%多聚甲醛中后固定6 h，隨后用20%和30%的蔗糖溶液梯度沉淀腦組織。自蔗糖溶液中取出腦組織，OCT包埋，用冰凍切片機進行中腦切片，厚度為35 μm。每隔6張切片取一張，共留取切片6組，每組至少留有6～8張切片。切片浸入磷酸緩沖液(PBS，以下均為0.01 mol/L，pH 7.4)，5 m in×3次→0.3%Triton X－100，室溫30 m in→PBS，5 m in×3次→0.3%H2O2，室溫30 m in→PBS，5 m in×3次→10%正常馬血清，室溫15 m in→吸去馬血清，滴加小鼠抗大鼠TH單克隆一抗(1∶10 000)，4℃，24 h→PBS，5 m in×3次→滴加馬抗小鼠二抗(1∶200)，室溫2 h→PBS，5 m in×3次→HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃，30 m in→PBS，5 min×3次→DAB顯色液顯色約5 m in→PBS→梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每只大鼠至少取6張切片進行黑質(zhì)致密區(qū)(substantia nigra pars compacta，SNpc)TH陽性細胞計數(shù)，并計算每只大鼠右側(cè)和左側(cè)陽性細胞數(shù)的比值。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法:采用GraphPad Prism 4.0軟件進行統(tǒng)計分析及作圖，數(shù)據(jù)以(±s)表示，兩組數(shù)據(jù)間差異用成組設(shè)計的兩樣本均數(shù)的t檢驗。以P＜0.05作為統(tǒng)計學(xué)差異的界限。

2 結(jié)果

2.1 PD模型大鼠黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元免疫組化結(jié)果

TH免疫組化染色結(jié)果顯示(圖1，彩插5)，術(shù)后4周Sham組大鼠損傷側(cè)(右側(cè))和未損傷側(cè)(左側(cè))黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元的存活率沒有明顯差別，而模型組大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，分布稀疏，殘存神經(jīng)元數(shù)量為未損傷側(cè)的(60.55±8.16)%(P＜0.01)。

2.2 阿樸嗎啡誘發(fā)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為與黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元存活率之間的相關(guān)性

術(shù)后4周APO可誘發(fā)Sham組大鼠出現(xiàn)向兩側(cè)的輕度旋轉(zhuǎn)行為，但左右側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)幾乎相同，在本實驗中其平均凈旋轉(zhuǎn)次數(shù)為(4.25±6.63)r/30 m in。在模型組大鼠中，向未損傷側(cè)凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)大于40 r/30 min的為15只，占模型組大鼠總數(shù)的60%。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示大鼠由APO誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為與黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元存活率之間呈明顯的負相關(guān)(R2=0.53，P＜0.01)。如圖2。

圖2 阿樸嗎啡誘發(fā)的大鼠旋轉(zhuǎn)行為與黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元存活率之間的相關(guān)性Fig.2 Correlation of apomorphine－induced rotations and dopam inergic neuron survival rate in the SNpc of parkinsonian rat model.Statistical analysis revealed a significant inverse correlation between the number of rotations over 30 min after the apomorphine injection and the decreased TH－positive neurons survival rate 4 weeks after MFB axotomy.R2，coefficient of determination.

3 討論

在疾病的研究過程中，一個好的動物模型不僅能幫助我們進一步解釋疾病病因?qū)W的根本機制，而且有助于新的神經(jīng)保護藥物和治療策略的研究發(fā)展，為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供必不可少的工具。現(xiàn)在PD研究中常用的動物模型主要包括化學(xué)損傷模型、機械損毀模型和轉(zhuǎn)基因動物模型，其中化學(xué)損傷模型應(yīng)用最為廣泛，所用的神經(jīng)毒素主要包括6－OHDA、MPTP和魚藤酮等［2］。6－OHDA是第一個被用來選擇性誘導(dǎo)DA能神經(jīng)元死亡的神經(jīng)毒素，它可通過介導(dǎo)細胞氧化應(yīng)激等反應(yīng)導(dǎo)致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元死亡，最終引發(fā)黑質(zhì)－紋狀體通路功能減退并產(chǎn)生類PD癥狀［3］，但其毀損模型產(chǎn)生的效應(yīng)一般為急性的，有研究報道6－OHDA注入黑質(zhì)和MFB后24h之內(nèi)DA神經(jīng)元開始死亡，95%的神經(jīng)元于3d內(nèi)死亡［4］，明顯不同于人類PD緩慢進展的病理特點，因此該模型常被用來模擬晚期PD的病理改變，多用于細胞移植和基因治療等實驗研究。MPTP是目前最為常用的制備PD動物模型的神經(jīng)毒素，MPTP靈長類模型在病理、生化及癥狀方面均與人類PD表現(xiàn)相似［5，6］，是目前最合適的動物模型之一，但由于經(jīng)濟、倫理道德等原因，靈長類模型還只在世界上少數(shù)幾個實驗室應(yīng)用。目前最為普遍應(yīng)用的MPTP模型為小鼠模型，但其各方面均不及靈長類模型經(jīng)典，病變過程通常是急性且可逆的，無法完全模擬PD的發(fā)病特點。近年來也建立了很多轉(zhuǎn)基因動物模型，但這些模型制備過程復(fù)雜、技術(shù)要求高和費用昂貴。

本實驗中我們采用的PD模型為可伸縮線刀切斷單側(cè)MFB建立的機械損毀大鼠模型。MFB為黑質(zhì)DA能神經(jīng)元發(fā)出的傳出纖維投射到紋狀體的通路，此通路是紋狀體DA的主要來源，紋狀體合成的神經(jīng)營養(yǎng)因子也是通過這條通路以逆軸漿轉(zhuǎn)運的方式到達SNpc，維持DA能神經(jīng)元的存活。因此損傷MFB后不僅可造成軸突末梢的變性還可造成DA能神經(jīng)元因缺乏逆向的營養(yǎng)支持而死亡。Knusel［7］和Lapchak［8］曾報道在MFB損傷后第18和19天損傷側(cè)DA能神經(jīng)元的死亡率分別為44%和50%，而且這種單側(cè)MFB切斷并不影響對側(cè)TH陽性神經(jīng)元的數(shù)量。Brecknell等［9］則通過逆向追蹤發(fā)現(xiàn)MFB損傷側(cè)的黑質(zhì)神經(jīng)元在損傷后1周時有28%的神經(jīng)元死亡，隨后呈進行性丟失，在第10周時黒質(zhì)神經(jīng)元死亡率達到最大，在此時只有29%的神經(jīng)元存活。這些結(jié)果表明該模型DA能神經(jīng)元的死亡是漸進性的，能較好地模擬PD病程長、進行性發(fā)展的病變特點，但這些研究并未闡明DA神經(jīng)元死亡數(shù)量和模型大鼠異常行為之間的關(guān)系。

行為學(xué)作為一種直觀可靠的指標(biāo)，在PD的發(fā)病機制研究、病程監(jiān)測及療效評價中發(fā)揮著重要作用。臨床資料顯示PD患者的主要行為學(xué)改變?yōu)殪o止性震顫、肌肉僵直和運動遲緩等。單側(cè)切斷MFB所建立的PD模型大鼠同樣可出現(xiàn)行為學(xué)的改變，如平衡協(xié)調(diào)能力下降及可出現(xiàn)由藥物誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為等。在本實驗中，注射APO能誘發(fā)Sham組大鼠向兩側(cè)的輕度旋轉(zhuǎn)行為，左右側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)幾乎相同，而模型組大鼠向未損傷側(cè)的旋轉(zhuǎn)行為明顯增加。一般認為，模型組大鼠旋轉(zhuǎn)行為增加的機制是黑質(zhì)DA能神經(jīng)元損傷、變性到一定程度，由于DA遞質(zhì)釋放量的急劇降低，引起紋狀體突觸后膜DA受體超敏。注射APO后可以強烈地激活損傷側(cè)紋狀體內(nèi)的DA受體，使動物向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。本實驗結(jié)果首次表明，線刀損毀MFB建立的帕金森病模型大鼠的異常旋轉(zhuǎn)行為與黑質(zhì)致密部TH陽性神經(jīng)元存活率之間呈明顯的負相關(guān)。TH是DA合成的限速酶，存在于DA能神經(jīng)元的胞質(zhì)內(nèi)，通過TH免疫組化染色法可判斷DA能神經(jīng)元的數(shù)目。因此在以后的實驗中，我們可以通過線刀損毀MFB建立的PD模型大鼠的異常旋轉(zhuǎn)行為判斷黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元存活率，如根據(jù)圖2所示，當(dāng)模型大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為130 r/30 min時，黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元存活率約為50%，從而為監(jiān)測PD的病情進展及各種治療方法的療效提供直觀的指標(biāo)。

(本文圖1見彩插5。)

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Correlation of Behavioral Changes and Survival Rate of Dopam inergic Neurons in the Substantia Nigra Pars Com pacta in Parkinsonian Rat M odel

LIU Li－min，LI Bo，SUN Zuo－li，JIA Jun，WANG Xuan，WANG Xiao－min
(Department of Physiology，School of Basic Medical Sciences，Capital Medical University，Key Laboratory of Neurodegenerative Diseases of the M inistry of Education，Beijing 100069，China)

ObjectiveTo exp lore the correlation of behavioral changes and survival rate of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta(SNpc)in parkinsonian rat model.M ethods The parkinsonian rat model was established by mechanical transection of the nigrostriatal dopamine pathway at the medial forebrain bundle(MFB). Behavioral studies were carried out by apomorphine challenge.Immunohistochemistry was applied on the tissue sections of substantia nigra(SN).The number of dopaminergic neurons was determined by counting the tyrosine hydroxylase(TH)－positive neurons in the sections.ResultsImmunohistochem ical studies confirmed a significant loss of TH－positive neurons on the lesioned side，while the rotations induced by apomorphine increased remarkably in the parkinsonian rat model..Conlusions At 4 weeks after the surgery，there is a significant inverse correlation between the number of apomorphineinduced rotations and the decreased survival rate of neurons in parkinsonian rat models established by mechanical transection of the nigrostriatal dopamine pathway at the medial forebrain bundle.

Parkinsonian rat model;MFB;Apomorphine;Dopaminergic neurons;Behavioral changes

Q－189

A

1005－4847(2010)05－0394－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.007

2010－04－21

國家自然科學(xué)基金(編號:30472245);首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)臨床科研合作基金(編號:10JL14)。

劉麗敏(1973－)，女，研究方向:帕金森病發(fā)病機制及防治研究。E－mail:liulimincn@yahoo.com.cn

王曉民。E－mail:xmwang@ccmu.edu.cn