滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

王海霞李金枝解其貴楊瑜董凌云左緒磊

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院婦產(chǎn)科,上海 200540;2.復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生中心科研部,上海 201508)

滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

王海霞1李金枝1解其貴1楊瑜2董凌云1左緒磊1

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院婦產(chǎn)科,上海 200540;2.復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生中心科研部,上海 201508)

目的:培養(yǎng)符合實(shí)驗(yàn)要求的人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞。方法:胰蛋白酶、膠原酶消化絨毛組織,進(jìn)行原代培養(yǎng),用胰蛋白酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)并純化。觀察其形態(tài)學(xué)特征并繪制生長(zhǎng)曲線,計(jì)算倍增時(shí)間。應(yīng)用光鏡、免疫熒光進(jìn)行細(xì)胞鑒定。Transwell小室法檢測(cè)其體外侵襲能力。結(jié)果:原代培養(yǎng)滋養(yǎng)層細(xì)胞24h貼壁,7～10d首次傳代,倍增時(shí)間3.42d,細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞角蛋白7而不表達(dá)波形蛋白。結(jié)論:胰蛋白酶、膠原酶消化法可獲得符合實(shí)驗(yàn)要求的人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞,能建立穩(wěn)定的人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。

滋養(yǎng)層細(xì)胞; 體外培養(yǎng)

AbstractObjective:To culture human first trimester cytotrophoblasts in vitro.Methods:Human first trimester cytotrophoblasts were isolate,purify and culture.The morphology characteristics were detected through microscopy,we drew growth curve and calculated the doubling time to describe its growth characteristics.Immunofluorescence was carried out to determined the expression of cytokine7and vimintin.Results:The cells adherence achieved24-48hours after seeding,7-10days later the cells were subcultured for the first time.The doubling time of cell population was3.4days.The cell populations expressed cytokeratin7but not vimentin.Transwell invasion experiment showed that the invasive capability remained in vitro.Conclusions: Typsin-collagenase digestion process can obtain human trophoblastic cells and also can establish a stable human trophoblastic cells culture systerm in vitro.

Key WordsFirst trimester cytotrophoblasts; In vitro

目前,對(duì)人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)行為及機(jī)制的體外研究越來(lái)越多,而人絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)是進(jìn)行這類研究的基礎(chǔ)。本研究對(duì)前人的方法進(jìn)行了比較、優(yōu)化,試圖建立一種簡(jiǎn)便、有效的人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞原代培養(yǎng)方法。

1 資料與方法

1.1 組織來(lái)源 取復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院婦產(chǎn)科計(jì)劃生育門(mén)診自愿終止妊娠婦女,自愿捐贈(zèng)的標(biāo)本10份,標(biāo)本為妊娠45～56d、乙型肝炎6項(xiàng)檢查均陰性孕婦的胎盤(pán)絨毛組織。標(biāo)本取得經(jīng)本院倫理委員會(huì)同意,患者同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Hyclone公司,胰酶購(gòu)自 Gibco公司,膠原酶、Ficoll購(gòu)自Sigma公司,小鼠抗人細(xì)胞角蛋白7(cytokeratin7)、波形蛋白(vimentin)均購(gòu)自Santa Cruz公司,Alexa594-兔抗鼠 IgG和DAPI均購(gòu)自Sigma公司,Metrigel購(gòu)自BD公司,Transwell購(gòu)自Corning Costar公司,培養(yǎng)板及培養(yǎng)皿購(gòu)自Corning公司,其他試劑(如臺(tái)盼蘭、多聚甲醛、PBS、Tween、TritonX100、結(jié)晶紫)為常規(guī)國(guó)產(chǎn)試劑。

1.3 早孕絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞原代培養(yǎng) 取妊娠45～56d發(fā)育正常的人工流產(chǎn)新鮮胎盤(pán)絨毛組織,參照Nagamatsu等[1]方法分離、培養(yǎng)人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞,置于含有雙抗的(100U·mL-1青霉素和100μg· mL-1鏈霉素)的無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液中,快速冰上運(yùn)送至超凈工作臺(tái)內(nèi),PBS沖洗3次,剪去胎膜組織及蛻膜組織,挑取絨毛組織,充分剪碎至糊狀,加0.1%胰酶和1mg·mL-1的膠原酶,37℃靜置消化30min,吹打后吸出細(xì)胞懸液,用含10%胎牛血清(FBS)、100U·mL-1青霉素和100μg·mL-1鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液終止消化,200目篩網(wǎng)過(guò)濾,將所得懸液與Ficoll細(xì)胞分離液,以1:1加入15mL離心管中,以1 200g離心30min,離心結(jié)束后離心管內(nèi)上下兩層液面交界處云霧狀灰白層即為絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞,小心吸取后用含10%FBS的1640培養(yǎng)液清洗2次,最后用含10%FBS的1640培養(yǎng)液在37℃5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24h后換液。

1.4 絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的傳代與純化 當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿的80%以上或局部區(qū)域因細(xì)胞接觸抑制或融合而停止生長(zhǎng)時(shí),進(jìn)行傳代。用含0.25%EDTA的胰酶,37℃消化1～3min,鏡下觀察到有部分細(xì)胞變圓、脫落時(shí),用含10%FBS的RPMI1640終止,去除脫落細(xì)胞。剩余細(xì)胞用PBS洗1次,再次用含0.25%EDTA的胰酶消化至所有細(xì)胞均變圓脫落,用含15%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液終止后吹打混勻,以1×105·mL-1接種于新培養(yǎng)皿中。上述方法傳代直至鏡下觀察細(xì)胞為較均一的上皮樣形態(tài)。

1.5 絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn) 取2～3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞,消化、計(jì)數(shù),用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104· mL-1,充分混勻后,以1mL/孔接種到24孔板中,次日起每24h消化計(jì)數(shù)其中3孔,根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,并依據(jù)以下公式計(jì)算倍增時(shí)間: TD=T×㏒2/㏒(N/N0)。

1.6 絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞免疫鑒定 滋養(yǎng)層細(xì)胞爬片培養(yǎng)48h后,用PBS洗滌3次,每次5min,多聚甲醛室溫固定15min,用PBS洗3次,含0.2%TritonX100的PBS室溫通透5min,PBS洗3次,1%兔血清室溫封閉1h,一抗4℃孵育過(guò)夜(cytokeratin7和vimentin均1:100稀釋),用0.1%PBS洗3次,二抗1:200,DAPI1:1000稀釋,室溫同時(shí)孵育1 h,PBS洗3次,抗淬滅甘油封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。低倍鏡下取3個(gè)視野,計(jì)算其純度。

1.7 絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞體外侵襲能力測(cè)定 Metrigel原液用PBS10倍稀釋,取40μL加入Transwell小室內(nèi)面,37℃凝固4h。細(xì)胞消化計(jì)數(shù),以無(wú)血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106·mL-1,將涂有Metrigel的Transwell置24孔板中,上室加入上述備好的細(xì)胞懸液0.1mL,下室加入含10%FBS的培養(yǎng)液0.6mL,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h取出。擦去上室細(xì)胞,4%多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,沖洗后晾干,判斷絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞穿透基底膜的能力。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞24h貼壁,48～72h完全鋪展開(kāi),細(xì)胞大,呈略不規(guī)則的圓形或橢圓形,細(xì)胞核相對(duì)較小,胞漿豐富,高倍鏡下見(jiàn)胞膜上有豐富的微絨毛和突起。顯示絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞特征,見(jiàn)圖1A。繼續(xù)培養(yǎng)1～2d,部分區(qū)域細(xì)胞自發(fā)聚集成簇發(fā)生融合,融合的細(xì)胞間連接緊密,胞核向中央集中,停止生長(zhǎng),顯示向合體滋養(yǎng)層細(xì)胞(syncytiotrophoblast,ST)分化的趨勢(shì),見(jiàn)圖1B。

圖1 絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察(A)細(xì)胞接種后48～72h(×100);(B)部分細(xì)胞聚集融合(×100);(C)細(xì)胞完全長(zhǎng)滿,單層生長(zhǎng)(×40)。

2.2 絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的體外生長(zhǎng)特性 初次培養(yǎng)7～10d,局部細(xì)胞接觸融合,停止生長(zhǎng)。此時(shí)予消化傳代,傳代后24h換液,去除死亡細(xì)胞,大部分細(xì)胞可以耐受胰酶消化,貼壁良好。傳代后細(xì)胞呈短梭形或多邊形,單層生長(zhǎng),失去相互融合特性,見(jiàn)圖1(C)。一般可傳代7～8次,2次傳代間隔為3～4 d。取第2～4代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞做生長(zhǎng)曲線,連續(xù)計(jì)數(shù)8d,結(jié)果顯示,細(xì)胞飽和密度為2.57×105·mL-1,倍增時(shí)間3.42d。生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 人絨毛細(xì)胞體外生長(zhǎng)曲線

2.3 免疫熒光檢測(cè)抗原表達(dá)情況 cytokeratin7陽(yáng)性細(xì)胞顯示為胞漿中紅色熒光,細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色后顯示為藍(lán)色。絕大部分細(xì)胞cytokeratin7表達(dá)陽(yáng)性,vimentin為陰性,表明經(jīng)分離純化得到的細(xì)胞為人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞,純度為92%。

2.4 人絨毛體外侵襲能力 體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞能夠穿透細(xì)胞外介質(zhì)膠(Metrigel),遷移到達(dá)小室外表面,表明體外培養(yǎng)的人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞仍能夠保持其侵襲能力(圖3)。

圖3 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)(×100)

3 討 論

人絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞體外培養(yǎng)常見(jiàn)的方法有組織帖塊法、胰酶-膠原酶混合消化法,胰蛋白酶-DNA酶消化法、單純胰酶消化法等[1-4]。組織消化法原代細(xì)胞生長(zhǎng)周期長(zhǎng),容易混雜成纖維細(xì)胞及其他間質(zhì)細(xì)胞,純度不夠。單純胰酶消化法作用時(shí)間長(zhǎng),往往需要反復(fù)消化,獲得細(xì)胞量少,加入DNA酶后消化速度明顯增加,但細(xì)胞損傷亦增加,細(xì)胞活性較差。而胰酶-膠原酶則相對(duì)溫和,可以獲得較多有活力的細(xì)胞。本研究對(duì)多種培養(yǎng)方法進(jìn)行了比較,最終選擇胰酶-膠原酶一次性靜置消化法,因反復(fù)消化或消化過(guò)程中反復(fù)振蕩都會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不同程度的損傷,且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。膠原酶可以分解間質(zhì)細(xì)胞,有效減少成纖維細(xì)胞污染。本實(shí)驗(yàn)分離出來(lái)的細(xì)胞并未以消化法、貼壁法等進(jìn)行純化,仍可獲得滿意的細(xì)胞純度,也證實(shí)了這一點(diǎn)。對(duì)于滋養(yǎng)層細(xì)胞的分離,不少人采用percoll梯度離心法[5],但后來(lái)有研究者[6]將percoll與Ficoll進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)兩者的分離效果無(wú)明顯差異,而后者省去了繁瑣的配制過(guò)程,應(yīng)用更加簡(jiǎn)便。故本研究采用Ficoll進(jìn)行分離。

細(xì)胞鑒定是培養(yǎng)細(xì)胞不可缺少的環(huán)節(jié),最常用的鑒定方法是形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)方法。通常情況下,離體培養(yǎng)的上皮來(lái)源細(xì)胞呈扁平的多角形,呈片狀鋪展生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)所獲得的細(xì)胞形態(tài)與之相符。目前對(duì)于鑒定滋養(yǎng)層細(xì)胞的分子標(biāo)記尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),比較認(rèn)同的是細(xì)胞角蛋白7(cytokeratin7)、波形蛋白(vimentin)。抗角蛋白抗體是目前應(yīng)用最為廣泛的鑒定分離純化的滋養(yǎng)層細(xì)胞的指標(biāo)。然而, Blaschitz等[7]報(bào)道,不同類型的細(xì)胞角蛋白和廣譜的細(xì)胞角蛋白并不具有滋養(yǎng)層細(xì)胞特異性,大多數(shù)抗細(xì)胞角蛋白抗體都既可與滋養(yǎng)層細(xì)胞反應(yīng),又可與絨毛間質(zhì)細(xì)胞結(jié)合。在被檢測(cè)的13個(gè)抗細(xì)胞角蛋白抗體中,僅抗cytokeratin7抗體對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞是特異性的。Frank等[8]也發(fā)現(xiàn),在人胎盤(pán)子宮基質(zhì)細(xì)胞中可表達(dá)多種細(xì)胞角蛋白,cytokeratin7對(duì)于滋養(yǎng)層細(xì)胞的特異性最強(qiáng),推薦用于鑒別滋養(yǎng)層細(xì)胞。波形纖維蛋白在成纖維細(xì)胞、子宮基質(zhì)細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性,而在滋養(yǎng)層細(xì)胞中則呈陰性,因此可借以將滋養(yǎng)細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞等區(qū)分開(kāi)來(lái)。本試驗(yàn)通過(guò)免疫熒光證實(shí),所分離培養(yǎng)的細(xì)胞絕大部分為滋養(yǎng)層細(xì)胞,純度較高。

本研究結(jié)果顯示,細(xì)胞經(jīng)7～10d培養(yǎng)后可進(jìn)行初次傳代,與部分文獻(xiàn)報(bào)道略有出入,考慮與計(jì)數(shù)誤差及接種密度有關(guān)。連續(xù)細(xì)胞計(jì)數(shù)得到細(xì)胞倍增時(shí)間為3.42d,表明滋養(yǎng)層細(xì)胞在體外仍具有良好的增殖能力,且可以穩(wěn)定傳代5～6次,足以滿足進(jìn)一步的研究需要。妊娠成功與維持依賴于滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲功能。胚胎的著床需要胚胎對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞識(shí)別、定位并與其粘附,然后穿透子宮內(nèi)膜表面,植入子宮內(nèi)膜基質(zhì)中。胚胎植入后,外周的滋養(yǎng)層細(xì)胞迅速分化為內(nèi)層的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和外層的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞,細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞增生活躍,具有侵襲功能,而外周的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞無(wú)侵襲能力。胎盤(pán)形成的一個(gè)重要生理變化就是細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜的螺旋動(dòng)脈,破壞動(dòng)脈壁,使動(dòng)脈管腔擴(kuò)大,這一過(guò)程的順利完成有賴于絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的正常侵襲,而滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲則受到細(xì)胞因子、粘附分子、細(xì)胞外基質(zhì)和蛋白水解酶及其組織抑制物等多種因素的調(diào)控。因此,體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞仍保持其侵襲能力是我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,滋養(yǎng)層細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)能夠穿透模擬基底膜,即仍保持了其侵襲遷移能力,故可以用作有關(guān)其侵襲機(jī)制及調(diào)控的研究。

根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道,不同的分離條件可以獲得不同種類的滋養(yǎng)層細(xì)胞,從而分別對(duì)其特性進(jìn)行研究。然而,本研究通過(guò)觀察培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞特性可以看出,細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞在體外可以自發(fā)融合為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞,而合體滋養(yǎng)層細(xì)胞經(jīng)消化傳代則失去其融合特性,呈單層生長(zhǎng),且可以達(dá)到較高密度。故動(dòng)態(tài)的研究觀察可能亦具有重要意義。

(致謝:感謝金山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室范衛(wèi)、史繼敏和張繼紅對(duì)本實(shí)驗(yàn)的大力支持與幫助。)

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Isolation and Differentiation of Human First Trimester Trophoblasts

WA N G Haixia1L I J inzhi1X I E Qigui1YA N G Yu2DON G L ingyun1ZUO X ulei11.Department of Obstetrics and Gynecology, J inshan Hospital,Fudan University,S hanghai 200540,China;2.Scientif ic Research Center,S hanghai Public Health Clinical Center S hanghai 201508,China

Q813.1+1

A

左緒磊,E-mail:xulei_zuo@hotmail.com