果膠酸類物質的酶解及其對DCS穩定性的影響

張春輝 詹懷宇 李 靜 李兵云 付時雨

(華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室,廣東廣州,510640)

果膠酸類物質的酶解及其對DCS穩定性的影響

張春輝 詹懷宇 李 靜 李兵云 付時雨

(華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室,廣東廣州,510640)

選用兩種商品果膠酶制劑,首先優化其酶解果膠類物質的反應條件,結果發現,兩種果膠酶在pH值9.0,溫度為60～70℃的較優條件下可以有效地酶解果膠類物質和馬尾松化學機械漿DCS,降低其陽離子需求量(CD值)。在探求兩種果膠酶酶解果膠類物質的機理時,得出在對PGA類物質(酸性果膠物質)進行果膠酸(鹽)裂解酶(PGL)處理以降低CD值時,沒有必要將其完全酶解成單體,而只需將其聚合度降為6左右即可。堿性果膠酶(PL)處理果膠時也有類似的結果。同時發現,在漂白漿DCS中的果膠類物質主要是以果膠酸的形式存在,在選用果膠酶時應選用PGL。馬尾松化學機械漿DCS經PGL酶處理以后雖然對提高DCS的穩定性作用不大,但可以減緩其沉淀的速度。

果膠酶;溶解與膠體物質;酶解機理;聚合度

機械漿生產過程中,各種木材組分會釋放到過程水中[1-2],其中溶解與膠體物質(DCS)會隨白水循環次數的增多在白水中積累,給濕部操作和產品質量帶來一系列問題,如紙機運轉性能下降、紙張質量下降(紙頁中的小孔、斑點等)、助留劑無效消耗等[3-4]。

機械法制漿過程中生成的陰離子雜質主要是聚半乳糖醛酸。研究發現,這些果膠酸類物質不僅會消耗陽離子型助劑,而且易與鈣離子形成不溶聚集物,加速體系的失穩。Thornton等利用商品果膠酶(PextinexUltra SP-L)處理機械漿過氧化氫漂白濾液中的DCS,發現該酶可以解聚聚半乳糖醛酸,并使其陽離子需求量從431μmol/L降至248μmol/L[5]。這說明,在造紙過程中為防止果膠酸(聚半乳糖醛酸)與陽離子型助劑發生絡合,采用果膠酶處理是很有用的[6]。到目前為止,對于果膠酸類物質的酶解(果膠酶處理)的研究絕大多數停留在其酶解的最終效果,即酶解處理對陽離子型助劑用量的影響,而對果膠酶的具體酶解機理及其對DCS體系的穩定性方面的研究較少。

因此,本研究以此為切入點,首先優化果膠酶降解果膠酸類物質的反應條件,再在較優條件下探求其降解果膠酸類物質的機理,最后用果膠酶處理化學機械漿中的DCS,探討其對降低陽離子需求量(CD值)的效果,并研究果膠質降解后對體系中膠體物質穩定性的影響。

1 實 驗

1.1 實驗原料

實驗用果膠酶A由中國諾維信(天津)公司提供,果膠酶B為堿性果膠酶,EDT公司生產。馬尾松CT MP取自廣州造紙股份有限公司。

CaCl2(分析純),果膠酸類物質PGA(Sigma公司),半乳糖醛酸(Sigma公司)、DNS試劑、果膠(Sigma公司)、Tris-HCl(三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽)緩沖液。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活的測定

果膠裂解酶(pectin lyase)和果膠酸(鹽)裂解酶(pectate lyase)是兩種主要的果膠裂解酶,前者可以降解果膠,后者可以降解聚半乳糖醛酸。實驗采用兩種果膠酶,一種為堿性果膠酶(PL),一種為果膠酸(鹽)裂解酶(PGL)。

PL酶活的測定:基于3,5-二硝基水楊酸與醛糖共熱能產生棕紅色的氨基化合物,在一定范圍內還原糖的量和含有呈色氨基化合物的反應液顏色深淺成正比,在540 nm下測其吸光度,從而可計算出果膠酶活力。底物為果膠,取1.00 g果膠用pH值8.0的Tris-HCl緩沖液溶解,恒速攪拌1.5 h,用緩沖液定容至100 mL。以半乳糖醛酸為底物測定并繪制標準曲線。酶活力單位為1 mL酶液在50℃、pH值8.0的條件下,1 h分解果膠產生1 mg半乳糖醛酸為一個酶活單位。具體測定步驟見參考文獻[7]。此條件下測定的酶活為4000 U(測定時稀釋500倍)。

PGL酶活的測定[8]:酶解產物——不飽和低聚半乳糖醛酸在235 nm處的紫外吸收值與其濃度成正比關系,ε=4.6×103L/(mol·cm)。通過測定單位時間內生成的低聚醛酸的量來表征酶的活力。一個酶活單位為1 mL酶液在30℃、pH值7.5的條件下,每分鐘酶解果膠酸鈉生成1μmol不飽和低聚半乳糖醛酸為一個酶活單位,用U表示,單位U/mL。計算公式為:

式中,ΔA/Δt為吸光度變化速率,Dr為稀釋倍數,V1測定液的總體積,V2測定所用酶液的體積, 4.6為系數。此條件下測得的酶活為125 U/mL。

1.2.2 DCS的制備

CT MP漿的漂白:化學品用量H2O24.0%, NaOH 2.0%,Na2S iO33.0%,EDTA 0.2%,MgSO40.05%,60℃,90 min,漿濃10.0%。

DCS的制備:取漂后濃漿(未洗滌)加蒸餾水稀釋至1.0%漿濃,用鹽酸調節pH值為5.5左右,隨后在60℃下攪拌3 h,懸浮液經離心(500 g,30 min),小心移取上清液即得DCS。

1.2.3 其他參數的測定

濁度的測定采用美國HACH公司的2100N型濁度儀測定,單位NTU。

陽離子需求量(CD值)的測定:采用Mutek PCD03型膠體電荷自動滴定儀。標準陽離子物質為1000μmol/L的聚二烯丙基二甲基氯化銨(P-DADMAC)。樣品體積為10 mL。

2 結果與討論

果膠酶是可以水解果膠類聚合物中糖苷鍵的酶的總稱。有的果膠酶可以優先水解甲基化的果膠,而有的果膠酶可以優先水解未甲基化的果膠。機械漿的堿處理過程中溶出的果膠是未被甲基化的[9],因此,內切果膠酶對降低果膠的聚合度比外切果膠酶更為有效。因此,在紙漿的酶處理中多采用內切聚半乳糖醛酸酶(EC 3.2.1.15 poly-[1,4-α-D-galacturonide]-glycanohydrolase)。

2.1 PGL酶解果膠酸模型物及DCS的機理

果膠酸(鹽)裂解酶(PGL)可以降解聚半乳糖醛酸(鹽),而不能直接降解果膠。因此選用酸性聚糖PGA的鈉鹽作為底物,研究各影響因素如pH值、溫度、酶用量等對降低CD值的影響,并據此優選出較佳的處理條件。先進行小樣實驗,用不同pH值的Tris-HCl緩沖溶液配制1.0 g/L的PGA溶液,測定不同pH值和溫度下PGA的CD值的變化情況,反應時間為120 min,結果如圖1～圖3所示。

圖4 PGL用量對產物CD值及其吸光度的影響

從上面的小樣品實驗得出,PGL處理PGA時較優的條件為pH值9.0,溫度60℃。在此基礎上,為研究PGL酶解果膠酸類物質PGA的機理,另取12 mL PGA水溶液,用鹽酸和NaOH調節pH值為9.0,在60℃下,反應120 min,測定產物的CD值;同時將產物稀釋一定的倍數,測定其在235 nm的吸光度,結果如圖4所示。

從圖4中可以看出,隨著PGL用量的增加,產物的CD值開始降低較快,當PGL用量超過1.25 U之后變化不大;吸光度逐漸升高。CD值的下降反映PGA聚合度DP的減小,吸光度的增大說明產生了更多的不飽和低聚半乳糖醛酸基。圖4還可以看出, PGL用量超過1.25 U之后,產物的吸光度仍然有較為明顯的上升。這說明CD值與吸光度之間并不成比例關系。根據朗伯比爾定律:

其中,A為吸光度;ε為系數;b為吸收層厚度(cm);c為濃度。

據此得出反應過程中產生的不飽和醛酸末端基的濃度為:

C=ΔA/4.6

反應物中PG A的濃度為0.8 g/L,即4.04 mmol/L。由此得出PGA聚合度(DP)隨PGL用量的變化趨勢,以及CD值與DP的關系,如圖5和圖6所示。

圖5 PGA聚合度隨PGL加入量的變化趨勢

圖6 PGA的CD值與其聚合度之間的關系

從圖5可以看出,隨著PGL用量的增加,PGA的聚合度開始時下降迅速,PGL用量為0.25 U時平均DP已降低6～7;但繼續增加PGL用量,PGA的DP變化不大,用量為10 U時,DP降至3～4。之所以PGA的DP沒有降至1(即完全酶解成單體),可能與果膠酶本身的降解能力和實驗所用的時間(120 min)有關。

另外,得出了PGA的CD值與其DP的關系。從圖6中可以看出,在DP較小時(<6),PGA仍會消耗少量的陽離子聚合物(P-DADMAC);當聚合度超過6時,PGA的CD值開始明顯上升。因此,從經濟和效率的角度出發,在對PGA類物質進行果膠酶處理以降低CD值時,沒有必要將其完全酶解成單體,而只需將其聚合度降為6左右即可。

接著用PGL處理馬尾松CT MP漂白漿DCS,實驗結果如圖7所示。從圖中可以看出,PGL可以有效地去除果膠質,降低DCS的CD值。研究得知, DCS的CD值主要來自DS(溶解性物質)部分,約占總CD值的70%～80%。但是果膠酶處理以后, CD值只下降了約40%,這說明DS中不僅果膠質會消耗陽離子聚合物,其他的陰離子性物質也會消耗陽離子聚合物。Thornton等也獲得類似的結果,他們利用商品果膠酶(Pextinex U ltra SP-L)處理機械漿過氧化氫漂白濾液的DCS樣品,可以導致聚半乳糖醛酸的解聚,并且CD值從431μmol/L降至248μmol/L[5]。

圖7 PGL用量對馬尾松漂白漿DCS的CD值的影響

2.2 PL酶解果膠模型物及DCS的機理

選用果膠作為底物,研究各影響因素如pH值、溫度對PL酶酶活的影響,并據此優選出較佳的處理條件為溫度70℃,pH值9.0(實驗結果未列出)。在此較優條件下,通過測定CD值的變化,來探討PL對果膠和DCS的處理效果。實驗條件為pH值9.0,溫度70℃,時間120 min,100℃下滅活5 min;果膠(1.0 g/L)5 mL,總體積15 mL。結果如圖8所示。圖中PL用量均以標準測定方法(溫度50℃,pH值8.0)測得的酶活4000 U/mL來計量的。

圖8 PL用量對酶解產物CD值的影響

從圖8中可以看出,PL酶可以有效地酶解果膠模型物,當用量為200 U時,果膠的CD值下降約80%。但從變化趨勢來看,PL用量大于80 U以后, CD值下降甚為緩慢。另外,還將產物稀釋并測定其在235 nm處的吸光度,發現了與PGL處理PGA時類似的現象(如圖9所示),即CD值基本保持不變,而吸光度不斷地增大,進一步證明了果膠類物質只有在DP超過一定值時才會與陽離子聚合電解質反應。

圖9 PL用量對產物吸光度的影響

將PL酶用于馬尾松漂白漿DCS的處理。條件為:pH值9.0,溫度70℃,時間120min;DCS的制備略有改動,漿濃為2.0%以增加DCS的濃度。實驗結果如圖10所示。

圖10 PL用量對馬尾松漂白漿DCS的CD值的影響

從圖10中可以看出,隨著PL用量的增加,DC的CD值逐漸減小,當PL用量為80 U時,DCS的CD值下降30%。比較圖7和圖10發現,在實驗范圍內,PL對馬尾松漂白化學機械漿DCS的處理效果不如PGL。通過實驗發現,PL對PGA和果膠都有酶解作用,但對果膠更為有效;而PGL對PGA的酶解效果較好,對果膠也有一定的酶解作用(可能是果膠中含有一定量的果膠酸)。因此,推斷在漂白漿DCS中的果膠類物質主要是以果膠酸的形式存在(未被甲基化),在選用果膠酶時應選用PGL;處理紙漿時應選用PL。

2.3 PGL酶解處理對DCS穩定性的影響

果膠酸主要是在H2O2漂白過程中產生的,是水系統中陰離子垃圾的重要來源,易與鈣離子結合,對鈣離子引起的凝聚具有促進作用[10-11]。果膠酶PGL雖然可以通過酶解果膠質來降低馬尾松漂白化學機械漿DCS的CD值,但果膠質酶解以后可否在一定程度上提高DCS的穩定性需要進一步研究。因此,選用PGL處理馬尾松漂白化機漿的DCS。條件為:DC 300 mL,pH值9.0,溫度70℃,時間120 min。處理以后的DCS樣品調節pH值為5.0、溫度60℃,然后加入一定量的預熱至60℃的CaCl2溶液,反應30 min,離心(500 g,30 min)取上清液測其濁度結果如圖11所示。

在未經酶處理的體系中,碳水化合物(中性聚糖和果膠質)會吸附在膠體顆粒的表面;加入鈣離子以后,由于果膠質的存在兩者起到類似“架橋”的作用,將膠體顆粒絮凝并沉淀下來,果膠質與鈣離子反應生成的聚集物并非在體系中單獨存在,而是始終與膠體顆粒連在一起,并在離心時沉淀下來,所以體系沒有出現濁度上升的現象。

圖11 PGL處理對馬尾松漂白化機漿DCS穩定性的影響(離心)

然而,從圖11中可以看出,PGL處理以后的DCS樣品中加入少量鈣離子時,體系的濁度急劇升高,但這不能說明處理以后的樣品穩定性提高了。在實驗中發現,酶處理以后的樣品在加入鈣離子后會變得更加渾濁,樣品中產生白色絮團(比水輕),甚至產生分層現象。這是因為經過果膠酶處理以后,部分果膠質會從膠體顆粒的表面釋放到水相中;當加入鈣離子時,這些“游離”的低DP果膠質就會與之反應生成不溶物,但由于鈣離子的加入量較少,生成的不溶物不足以相互聚集并在離心時沉淀下來,而是懸浮在樣品中,造成濁度的非正常升高。當加入的鈣離子足夠多時,不溶物絮團增大,在離心時被除去,濁度開始快速下降;表現在圖中就是,殘余濁度曲線出現明顯的拐點(見圖中大圓點)。PGL用量為240 U時曲線的拐點要小于60 U的,且曲線后段的斜率也大(絕對值),因為前者酶解產生的“游離”低聚果膠質多,易于生成大絮團。

為了盡量消除鈣離子與果膠質生成的不溶物對濁度測定的影響,將最后的離心過程改為過濾。取少量反應后的樣品,用GF/A(孔徑1～2μm)玻璃纖維濾紙進行過濾,取濾液測定其濁度。得到的實驗結果如圖12所示。從圖12中可以看出,DCS經PGL處理以后,穩定性改善不明顯。結合圖11的分析可以得出,馬尾松化學機械漿DCS經PGL酶處理以后雖然對提高DCS的穩定性作用不大,但可以減緩其沉淀的速度。

圖12 PGL處理對馬尾松漂白化學機械漿DCS穩定性的影響(濾液)

3 結 論

3.1 果膠酸(鹽)裂解酶(PGL)可以降解果膠酸模型物PGA,降低其陽離子需求量(CD值),較優的條件為pH值9.0,溫度60℃,120 min。

3.2 PGA在聚合度較小時(<6),僅消耗少量的陽離子聚合物(P-DADMAC);當聚合度超過6時, PGA的CD值開始明顯上升。因此在對PGA類物質進行果膠酶處理以降低CD值時,沒有必要將其完全酶解成單體,而只需將其聚合度降為6左右即可。

3.3 PGL果膠酶可以去除馬尾松化學機械漿DCS中的果膠酸類物質,降低其CD值;但處理以后,CD值只下降了約40%。因此不能僅僅靠果膠酶來完全降低DCS的CD值。

3.4 堿性果膠酶PL可以有效地酶解PGA,當用量為200 U時(底物5 mg),果膠的CD值下降約80%。較優的處理條件為:溫度70℃,pH值9.0, 120 min。同時,PL可以有效地降低馬尾松漂白漿DCS的CD值。在漂白漿DCS中的果膠類物質主要是以果膠酸的形式存在,在選用果膠酶時應選用果膠酸(鹽)裂解酶PGL。馬尾松化學機械漿DCS經PGL酶處理以后雖然對提高DCS的穩定性作用不大,但可以減緩其沉淀的速度。

[1] Thornton J,Ekman R,Holmbom B,et al.Polysaccharides dissolved from Nor way spruce in ther momechanicalpulping and peroxide bleach ing[J].Journal of Wood Chemistry and Technology,1994,14 (2):159.

[2] Thornton J,Ekman R,Holmbom B,et al.Release of potential“an ionic trash”in peroxide bleaching ofmechanical pulp[J].Pap Puu, 1993,75(6):426.

[3] FrancisD W,OuchiM D.Effect of dissolved and colloidal solids on newsprint properties[J].Journal of Pulp and Paper Science,2001, 27(9):289.

[4] Nur miM,Byskata J,Eklund D.On the interaction between cationi polyacrylamide and dissolved and colloidal substances in thermome chanical pulp[J].Paperi ja Puu/Paper and Timber,2004,86 (2):109.

[5] Thornton J W.Enzymatic degradation of polygalacturonic acids re leased from mechanical pulp during peroxide bleaching[J].Tapp Journal,1994,77(3):161.

[6] Heli Kangas K,Espoo F,Anna Suurn?kki V,et al.Modification o the surface chemistry of T MP with enzymes[J].Nordic Pulp and Pa per Research Journal,2007,22(4):415.

[7] Shobha M,Vishu Kumar A,Tharanathan R,et al.Modification o guar galactomannan with the aid of Aspergillus niger pectinase[J]. Carbohydrate Polymers,2005,62(3):267.

[8] Solbak A,Richardson T,McCann R,et al.Discovery of pectin-degrading enzymes and directed evolution of a novel pectate lyase for processing cotton fabric[J].Journal of Biological Chemistry,2005, 280(10):9431.

[9] Sundberg K E,SundbergA C,Thornton J W,et al.Pectic acids in the production of wood-containing paper[J].Tappi Journal,1998, 81(7):131.

[10] Sundberg K,Thornton J,Holmbom B,et al.Effects of wood poly saccharides on the stability of colloidal wood resin[J].Journal o Pulp and Paper Science,1996,22(7):226.

[11] Garnier C,AxelosM A V,Thibault J-F.Phase diagrams of pectin calcium systems:influence of pH,ionic strength,and temperatur on the gelation of pectins with different degrees of methylation[J]. Carbohydrate Research,1993,240:219.

Abstract:The efficiency and mechanism of two pectinases degrade or hydrolyze model substances and DCS from Masson pine BCT MP wer evaluated.The optimal conditions for pectate lyase(PGL)and alkaline pectinase(PL)treatmentwere as follows:pH 9.0,60℃,120mi for PGL,and pH 9.0,70℃,120 min for PL.Both pectinase could effectively degrade the pectics in the DCS ofMasson pine BCT MP,wit PGL beingmore efficient,due to the unmethylated for m of pectic substances inDCS ofBCT MP.The hydrolysismechanis m of PGA with PGL was investigated.The results showed that it was not necessary to hydrolyze the polymeric pectics to be monomers,in order to reduce it cationic demand,instead itwas hydrolyzed to a average DP of 6 would be acceptable.TreatmentofDCS from Masson pineBCT MPwith PGL could not preventDCS from complete aggregation by calcium ions,but the rate of aggregation was lowered.

Keywords:pectinase;dissolved and colloidal substances;enzymatic hydrolysismechanism;degree of polymerization

(責任編輯:孫秋菊)

Enzymatic Hydrolysis of Pectic Substances and its Effect on the Stability of DCS from Mason Pine BCTM P

ZHANG Chun-hui＊ZHAN Huai-yu L IJing L IBing-yun FU Shi-yu
(State Key Lab of Pulp and Paper Engineering,South China University of Technology, Guangzhou,Guangdong Province,510640)
(＊E-mail:chunhui@scut.edu.cn)

Q55

A

1000-6842(2010)-02-0039-06

2010-02-01(修改稿)

國家自然科學基金資助項目(編號20676047,30771689)和中國(廣州)留學生交流會難題招賢項目(200621-I0021)。

張春輝,男,1979年生;博士;主要從事二次纖維利用、膠黏劑控制以及生物質轉化等方面的研究。

E-mail:chunhui@scut.edu.cn