響應面法優化漂白漿酶水解

呂 健 詹懷宇 付時雨

(華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室,廣東廣州,510640)

響應面法優化漂白漿酶水解

呂 健 詹懷宇 付時雨

(華南理工大學制漿造紙工程國家重點實驗室,廣東廣州,510640)

采用響應面法中的Box-Behnken實驗設計,研究了溫度、酶用量和pH值對漂白針葉木漿酶解效率的影響,分別提出了用于預測可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率的數學模型。通過規劃求解,優化了3個因素:當溫度、酶用量和pH值分別為52.8℃、10 g/L、5.5以及45.9℃、10 g/L、5.3時,可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率分別達到最大81.5%和54.3%。通過實驗數據與預測數據的對比,證明模型具有準確的預測性能。

纖維素;漂白漿;酶水解;響應面法

纖維素是自然界中儲量最大的可再生聚合物,年產量約為1011～1012t[1]。隨著化石能源的日益缺乏、生物質能源的迅速發展,利用纖維素基原料,通過纖維素酶水解產生葡萄糖進而轉化為乙醇或能源氣的研究引起了人們的極大關注[2-3]。其中,纖維素轉化為可發酵的可溶糖和葡萄糖的效率是評價能否工業應用的關鍵。

纖維素酶解是在一個由纖維素原料、纖維素酶和反應器組成的復雜的固液體系中進行的,因此影響纖維素酶水解的因素也非常復雜[4]。從纖維素原料性質上來說包括纖維素的結晶度、聚合度、表面積等[5-7],從酶的性質上包括內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的組成與活性[8-9]。從工業上來說,人們更關心工藝條件的影響,主要包括反應溫度、pH值、反應時間、底物濃度和酶用量等[10-11]。這些因素并不是單獨影響纖維素酶解效率的,因素間存在協同效應。

為了研究工藝因素對纖維素酶解的影響以及協同效應,優化纖維素酶解效率,本實驗采用響應面實驗設計法研究了溫度、酶用量和pH值對漂白針葉木漿酶解效率的影響。響應面法是一種利用數理統計知識,通過數學建模和分析,評估多個自變量單獨和同時對因變量影響的方法,其主要目標是利用模型優化因變量的響應[12-13]。響應面曲線法的優點在于能從最少的實驗次數中獲得最多的信息,其數學模型采用多元二次方程,形式如式(1)所示:

其中,Xi和Xj表示自變量,Y表示響應變量, β0、βi、βii和βij為方程的系數,βi、βii和βij分別代表因素的線性影響、平方影響和因素間的協同影響。在自然科學研究和工程研究中,該方法得到了廣泛的應用[1415]。

1 實 驗

1.1 實驗藥品、原料及儀器

漂白針葉漿:取自國內某廠。

纖維素酶:Pergalase7547(來源于Trichoder m a reesei),酶活力12.8 FPU/mL。

總有機碳測定儀(TOC-VCSH,SH IMADZU):日本島津公司生產。

離散式全自動化學分析儀(DA3500):美國O.I.Analytical公司生產;結合Megazyme公司生產的D-葡萄糖檢測試劑包,用于葡萄糖的定量測定。

緩沖溶液:根據實驗條件,配置pH值范圍為3～7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.2 實驗過程

將漂白針葉木漿分散于不同pH值、濃度0.5mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中,配制成質量濃度10 g/L的纖維懸浮液。加熱至預定溫度并保持20 min,確保紙漿纖維分散均勻。然后在反應器中加入纖維素酶,保持攪拌速度300 r/min,反應進行24 h后取樣,離心過濾后取濾液測定樣品中有機碳含量和葡萄糖含量。通過反應前后的有機碳含量和葡萄糖含量計算纖維的可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率。可溶糖包括纖維素降解后溶解在水解液中的葡萄糖、纖維二糖和纖維多糖。

可溶糖轉化率Y1(%)計算公式為:

葡萄糖轉化率Y2(%)計算公式為:

1.3 實驗設計與數據分析

本實驗采用響應面法中的Box-Behnken實驗設計,主要研究反應溫度(X1)、纖維素酶用量(X2)和pH值(X3)3個因素對纖維素酶解過程中可溶糖轉化率(Y1)和葡萄糖轉化率(Y2)的影響。實驗設計和回歸分析均在Design Expert(7.1.5,Statease, Inc.,USA)軟件中運行。

2 結果與討論

2.1 初步實驗結果

影響纖維素酶水解的工藝因素主要有反應溫度、pH值、反應時間、底物質量濃度和酶用量等。初始進行了單因素實驗,研究了每個因素對纖維素酶解葡萄糖轉化率的影響,以確定各因素的取值范圍。

底物濃度的選擇與反應器的形狀以及攪拌強度有關,本實驗以錐形瓶為反應器,置于振蕩水浴中進行。由于攪拌強度較弱,為了使反應均一,底物質量濃度不宜太高,本實驗中選擇10 g/L。實驗證明,在本實驗條件下,底物濃度太高不利于紙漿纖維的酶解。紙漿纖維的酶解效率隨反應時間增加不斷增加,只是反應速率逐漸減小。單因素實驗證明,反應時間超過24 h后,酶解效率提高幅度已很低。因此,在響應面實驗設計中再研究底物質量濃度和反應時間兩個因素顯得意義不大。因此固定底物質量濃度為10 g/L,反應時間為24 h,在響應面實驗設計中僅研究反應溫度、酶用量和pH值的影響。

本實驗使用的纖維素酶為工業用酶,其酶活較低(12.8 FPU/mL),實驗中其用量取值范圍較高,為2～10 g/L。反應溫度對纖維素酶解葡萄糖轉化率影響的單因素實驗(酶用量6 g/L,pH值4.8)的結果表明(實驗數據略),本實驗所選用的纖維素酶最適宜的反應溫度在40～60℃之間,在該溫度范圍之外的葡萄糖轉化率明顯降低。pH值對纖維素酶解葡萄糖轉化率影響的單因素實驗(反應溫度50℃,酶用量6 g/L)結果表明(實驗數據略),在一個較寬的pH值范圍(3～7)內,葡萄糖轉化率較高,且區別并不大。

根據初始的實驗結果,確定下一步響應面實驗設計中反應溫度的中心點為50℃,步長為10℃;酶用量的中心點為6 g/L,步長為4 g/L;pH值的中心點為5,步長為2。實驗設計的變量與取值如表1所示。

表1 漂白漿酶解變量的取值范圍

2.2 Box-Behnken實驗

根據響應面法中的Box-Behnken實驗設計,考察3個自變量時需要17組實驗,如表2所示,這些實驗是由3個因素不同組合起來得到的。

為了減少系統誤差,從實驗設計的標準次序中隨機抽取,進行了實驗序號重排。所有的實驗都經過3次測量,取平均值,并且保證相對偏差在5%以內各組實驗得到的可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率結果見表2。

從表2結果可知,通過改變溫度、酶用量和pH值,可溶糖轉化率在40%～80%間變化,葡萄糖轉化率在15%～55%間變化。不同的因素組合下,可溶糖和葡萄糖的轉化率差異很大。反應溫度從40℃提高到60℃,可溶糖轉化率提高,但是葡萄糖轉化率下降(標準序號1、2,標準序號3、4,標準序號5、6或者標準序號7、8);酶用量從2 g/L提高到10 g/L,可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率都顯著提高(標準序號1、3、標準序號2、4,標準序號9、10或者標準序號11、12);pH值從3提高到7,可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率有少許增加(標準序號5、7、標準序號6、8,標準序號9、11或者標準序號10、12)。

表2 Box-Behnken實驗設計與結果

2.3 模型的擬合及方差分析

通過對表2中17組實驗結果的回歸分析,利用式(1)對所有數據進行擬合,得到了表示可溶糖轉化率(Y1)和葡萄糖轉化率(Y2)的回歸方程,分別為:

式(4)和式(5)即為以溫度(40～60℃)、酶用量(2～10 g/L)和pH值(3～7)為自變量時,可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率的預測模型。圖1和圖2分別為可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率的模型預測值與實驗值的對應關系,從圖1～圖2可見預測值與實驗值吻合非常好。

為了說明以上兩個模型的有效性,利用Design Expert分別對其做了方差分析,可溶糖轉化率的方差分析如表3所示。

表3 可溶糖轉化率(Y1)模型的方差分析

從表3中看到,可溶糖轉化率模型(模型(2))的F檢驗值為32.7,p值<0.0001,說明該模型是顯著的。同時,對模型的Lack of Fit進行檢驗,其p值為0.1812。當Lack of Fit的p值>0.1時,認為是不顯著的,說明模型滿足預期假設。因此,該模型在統計上是證明可行的。同時模型中各項的方差分析表明,X1、X2、、和是模型中的顯著項(其p值均小于0.05),對因變量Y1起主要影響。方差分析得出,模型的R2值達到0.9768,說明模型具有很高的準確性。

表4為葡萄糖轉化率模型(模型(3))的方差分析,同樣,其模型的F檢驗值為158.5,p值< 0.0001,模型Lack of Fit的p值為0.1552,也說明了該模型在統計上的有效性。在對因變量Y2的影響上, X1、X2、X3、X1X2、、和都起顯著作用。模型的R2值高達0.9951,具有非常準確的預測性。

表4 葡萄糖轉化率(Y2)模型的方差分析

2.4 響應面曲線分析

圖3和圖4是分別根據數學模型(2)和模型(3),固定其中一個自變量而做出的三維響應面曲線圖,直觀地表示出了溫度、酶用量和pH值3個因素對可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率的影響。

從圖3(a)中可以看出,當pH值控制在5.0時,酶用量對可溶糖轉化率的影響大于溫度的影響。可溶糖轉化率隨酶用量的增加而增加,但隨溫度在40～60℃范圍內變化時,表現出先增加后減小的趨勢,說明在此溫度范圍內會存在一個最優溫度值使可溶糖轉化率達到最大值。圖3(b)為酶用量為6 g/L時,溫度和pH值對可溶糖轉化率的影響。同溫度一樣,隨著pH值從3增加到7,可溶糖轉化率也先增加后減小。在此圖中存在一個明顯的頂點,表明在實驗的溫度和pH值范圍內,有一個最佳的組合,使可溶糖轉化率最高。圖3(c)是溫度在50℃時,酶用量和pH值對可溶糖轉化率的影響。

圖4(a)、(b)、(c)為溫度、酶用量和pH值相互對葡萄糖轉化率的影響,其與圖3(a)、(b)、(c)的形狀相似,但峰型有差異,說明3個因素對葡萄糖轉化率的影響趨勢與其對可溶糖轉化率的影響趨勢相近,但是影響程度不相同。

2.5 漂白漿酶解影響因素的優化

在實際應用中,為了提高酶解效率,需要優化反應中的可變因素,達到期望的響應值。在固定其他因素時,可以利用模型(2)和模型(3)分別找出一組溫度、酶用量和pH值的取值組合,使可溶糖和葡萄糖的轉化率達到最高。模型的優化取值使用Excel(Mi crosoftOffice Excel 2007)中的“規劃求解”(Solve Tool)工具。求解結果如表5所示。

表5 漂白漿酶解影響因素優化取值

圖3 數字模型(2)三維響應面曲線圖

圖4 數字模型(3)三維響應面曲線圖

從表5中可以看出,當溫度為52.8℃、酶用量為10 g/L和pH值為5.5時,可溶糖轉化率達到最大,為81.5%;當溫度為45.9℃、酶用量為10 g/L和pH值為5.3時,葡萄糖轉化率達到最大,為54.3%。為了驗證此結果,在此優化條件下做了驗證實驗,實驗值和模型預測值的對比如表6所示。從表6可見,在優化條件下得到的可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率的實驗值與模型的預測值非常接近,說明模型(2)和模型(3)可準確地優化漂白漿酶解條件。

表6 優化條件下實驗值與模型預測值的對比%

3 結 語

本實驗利用響應面法中的Box-Behnken實驗設計對影響漂白針葉木漿纖維素酶水解的3個主要影響因素(溫度、酶用量和pH值)進行了研究。通過回歸分析,得出了2個三元二次多項式方程分別用于預測酶解過程中的可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率。方差分析證明模型在統計上是顯著有效的,可用于準確預測不同溫度、酶用量和pH值條件下的可溶糖轉化率和葡萄糖轉化率。通過對數學模型的規劃求解,得到了使響應變量達到最大的優化條件,分別為:當溫度為52.8℃、酶用量為10 g/L和pH值為5.5時,可溶糖轉化率達到最大81.5%;當溫度為45.9℃、酶用量為10 g/L和pH值為5.3時,葡萄糖轉化率達到最大54.3%。驗證實驗證明了模型優化的準確性。

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Abstract:Box-Behnken design in Response SurfaceMethodologywas employed to study the effects of temperature,cellulase dosage and pH on the efficiency of enzymatic hydrolysis of bleached softwood pulp.Two mathematic modelswere proposed to predict the conversion rates o soluble sugar and glucose.The three parameterswere optimized by solver tool inMicrosoft Excel.The optimal values of temperature,cellu lase dosage and pH formax imum soluble sugar conversion were found to be 52.8℃,10 g/L and 5.5,respectively.Those formaximum glu cose conversion were 45.9℃,10 g/L and 5.3,respectively.Comparing the experimental data and predicted data,the models were con firmed to be of high precision.

Keywords:cellulose;bleached pulp;enzymatic hydrolysis;response surface methodology

(責任編輯:常 青)

Opt im ization of Enzymatic Hydrolysis of Bleached Pulp by Response SurfaceM ethodology

LV Jian＊ZHAN Huai-yu FU Shi-yu

(State Key Lab of Pulp&Paper Engineering,South China University of Technology,Guangzhou,Guangdong Province,510640)
(＊E-mail:lv.jian328@gmail.com)

TS71+1;TP27

A

1000-6842(2010)02-0016-06

2010-01-04(修改稿)

本課題為國家973計劃(2007CB210201)資助課題。

呂 健,男,1982年生;在讀博士研究生;研究方向:制漿化學與生物化學。

E-mail:lv.jian328@gmail.com