流感病毒的分子生物學研究進展

張 偉，王承宇，楊松濤，高玉偉，夏咸柱，

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所 北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021; 2.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，長春 130062)

綜述與專論

流感病毒的分子生物學研究進展

張 偉1，2，王承宇2，楊松濤2，高玉偉2，夏咸柱1，2，

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所 北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021; 2.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，長春 130062)

流感病毒是分節段的負鏈RNA病毒，由RNA依賴的RNA聚合酶起始病毒的復制。流感病毒的特殊基因組結構和病毒蛋白的功能使其極易發生抗原轉換和抗原漂移，這使得病毒能夠逃避多種宿主的長效中和性免疫反應。本文從病毒結構、基因組及其編碼蛋白質、病毒復制過程和病毒的易感宿主等幾方面論述了流感病毒的分子生物學研究進展。

流感病毒;RNA病毒;抗原轉換;抗原漂移

流感病毒歸屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是分節段的負鏈 RNA病毒。根據核殼蛋白(NP)和基質蛋白(M)抗原性的差異，將流感病毒分為A、B和C型，三個型流感病毒的測序結果表明，他們來源于共同的祖先，但是，在遺傳學上，他們存在差異。A型流感病毒根據其抗原性差異分為16個血凝素(HA)亞型和9個神經氨酸酶(NA)亞型，其中人類感染似乎限于H1、H2、H3亞型和N1、 N2亞型，但是自 1997年以來，還出現了 H5N1、H7N7和H9N2亞型禽流感病毒直接感染人的報道，尤其是H5N1亞型高致病性禽流感病毒感染人群后會產生高致死率;豬流感病毒一般不感染人類，但是由于豬是流感病毒的中間宿主，所以重組之后的新型豬流感病毒可能會獲得感染人并致病的能力，例如，豬源2009甲型H1N1的全世界流行和爆發。這些動物源性的流感病毒在人群中的高致死率和廣泛流行，已經引起全世界高度關注。

1 病毒粒子的結構和組成

圖1 A型流感病毒的形態與結構［1］Fig.1 The structure of influenza A virus［1］

A型流感病毒的形態與結構如圖 1［1］。電鏡下，病毒呈球狀或絲狀，球狀時直徑達100 nm，絲狀時可長達300 nm。A型流感病毒粒子表面有兩種形態不一，長度均為10～20 nm的糖蛋白突起，即血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)，均具有抗原性，HA與NA比例為4∶1至5∶1。病毒粒子的表面還存在一種數量更少的跨膜蛋白——M2離子通道蛋白，M2與HA比例為1:10～100［2］。位于病毒粒子雙層脂質包膜下的是基質蛋白M1，它是病毒顆粒中含量最多的蛋白，構成病毒包膜的框架。在 M1內部與其連接的是核輸出蛋白(NEP;也被稱作非結構蛋白2，NS2)和病毒的核糖核蛋白(RNP)復合體。RNP在病毒內部，由4種蛋白和病毒的RNA組成:核蛋白(NP)是病毒核衣殼中主要的亞單位，它包繞著病毒的RNA基因組，還包括由三種多聚酶蛋白組成的RNA依賴的RNA多聚酶復合體，這三種蛋白分別為PB1、PB2和PA。B型流感病毒粒子的結構與A型相似，具有4種膜蛋白:HA、NA和NB、BM2 (代替M2);C型流感病毒粒子的結構不同于A型和B型流感病毒，它感染細胞后，在細胞表面能形成一個長達500 μm的索帶狀結構，但是 C型流感病毒在組份上與其他兩型是相似的，含有突出于外膜的糖蛋白、位于病毒粒子雙層脂質包膜下的基質蛋白和RNP復合體。C型流感病毒粒子只有一個主要的膜糖蛋白——血凝素酯酶融合蛋白(HEF)，它的作用相當于A型和B型流感病毒中的HA和NA;另外，在 C型流感病毒表面還有一個膜蛋白——CM2。

2 流感病毒基因組結構

表1 A/Tiger/HarBin/01/2002(H5N1)禽流感病毒的基因組與編碼蛋白Tab.1 The genomic segments and proteins of influnza A/Tiger/Harbin/01/2002(H5N1)virus

A型和B型流感病毒的基因組都由八個負鏈單股RNA片段組成，而C型流感病毒只有七個片段，A型流感病毒的基因組和編碼蛋白見表 1。A型和B型流感病毒基因組中的片段1、片段3、片段4和片段5每個只編碼一種蛋白:PB2、PA、HA和NP蛋白;所有的流感病毒的片段2都編碼聚合酶亞基PB1蛋白，在某些A型流感病毒中，片段2還編碼一個87個氨基酸組成的輔助蛋白——PB1-F2。PB1-F2是偶然發現的一種蛋白，人們原想尋找一些流感病毒基因編碼的、因改變閱讀框翻譯產生的、沒有功能的蛋白碎片，看能否被小鼠 CD8+T細胞識別，結果發現了由PB1+1閱讀框編碼的PB1-F2蛋白［3］。應用免疫熒光技術進一步發現，PB1-F2不象一般的“絮肽”只是少量分散在細胞中，而是在細胞線粒體中大量存在。PB1-F2能誘導細胞凋亡，推測是由于PB1-F2損害細胞內部的能量工廠——線粒體，殺死免疫細胞(單核細胞)，從而使機體無法對流感感染作出反應并抵抗病毒攻擊。

目前為止，在已確定的B型或C型流感病毒還沒有發現類似PB1-F2的蛋白。另外，A型流感病毒的片段6也只編碼一種蛋白——NA，而B型病毒的片段6編碼NA和NB基質蛋白(-1編碼閱讀框)，NB基質蛋白是一個膜整合蛋白，相當于 A型流感病毒的M2蛋白［4］。A型和B型流感病毒的片段7都編碼M1基質蛋白，在A型流感病毒中，M2離子通道蛋白是由片段7通過RNA剪切機制表達的［5］，而在B型流感病毒中，BM2是由片段7通過+2編碼閱讀框機制表達的［6］。最后，A型和 B型流感病毒的片段 8編碼非結構蛋白 1(NS1)［7］，并通過mRNA剪切機制產生NS2［8］，它是協助病毒RNP復合體出細胞核;一般來說，C型流感病毒的基因組結構與A型和B型相似，然而，C型流感病毒的HEF蛋白代替了HA和NA蛋白的功能，這樣，C型流感病毒的基因組就比 A型和 B型少了一條 RNA片段。

每一病毒RNA(vRNA)的末端都形成一個螺旋型發卡結構，并與RNA聚合酶復合體相連接;每個vRNA的剩余部分被富含精氨酸的NP蛋白所覆蓋，這樣的正電荷性網絡結構結合每個vRNA上的帶有負電荷的磷酸骨架。每個vRNA的3’和5’末端都含有長短不一的非編碼區，然而，每個片段的最末端在所有流感病毒基因組中都是高度保守的，這些部分的互補末端，通過堿基配對，作為vRNA復制的啟動子，同時也在轉錄過程中發揮作用。這些非編碼區還含有 mRNA多聚腺苷酸信號和病毒組裝的部分包裝信號。

Mandler等［9］通過對AIV溫度敏感突變株的研究證實，NP蛋白結合8個流感基因組RNA后形成核糖核蛋白體(RNP)的能力是AIV復制和感染必須的。通過對NP蛋白晶體 X光衍射分析發現，所有流感病毒的核糖核蛋白圓柱體末端均有由3個NP蛋白亞單位形成的環性結構，該結構包含病毒聚合酶的結合位點，是使病毒形成核糖核蛋白復合體(RNP)，保障病毒感染與復制的一個關鍵結構。研究者指出，核蛋白是傳播病毒的“元兇”之一，只要阻止NP蛋白圓柱體的形成，可能阻斷病毒的復制與感染［10］。

流感病毒的RNA聚合酶復合體包含三種蛋白，分別為PB1、PB2和 PA。它是多功能酶，同時也具有轉錄酶活性及核酸內切酶活性，其中聚合酶的PA蛋白能夠被胰蛋白酶切割為兩個部分，55 kD的PAC段部分(257-716)和25 kD的PAN端部分(1-256)。PAC主要和PB1N端部分結合(1-25)，晶體衍射實驗可以看到PAC的結構類似于龍頭狀，其分為兩個區域，區域一為腦袋部分，區域二為龍嘴部分;PAC龍嘴部分與PB1N端部分作用，序列分析表明這部分氨基酸在各型流感病毒上是保守的［11］。在vRNA的合成中，PA通過 PAN末端優先連接cRNA啟動子而不是 vRNA啟動子，這可能是 PAC的溝和通道輔助募集 cRNA［12］，但是另一個研究顯示 PB1連接 cRNA啟動子［13］，這需要進一步的研究。

禽流感病毒聚合酶的核酸內切酶活性對于從宿主mRNA上切割“帽”引物起始病毒mRNA的轉錄是非常關鍵的，以前的研究認為禽流感的內切酶活性在 PB1上，E508，E519和 D522起關鍵作用［14］。但是最近的研究表明，通過突變分析，PAN具有核酸內切酶活性，而非 PB1［15，16］;另外，PAN還具有穩定蛋白、結合帽子結構和結合啟動子等多種功能［17-19］。PA蛋白晶體結構的最新研究，尤其是PAC-PB1N相互作用的結構，豐富了我們對流感病毒復制和轉錄的分子生物學基礎的理解，也有助于我們了解 PB2如何發揮核輸入作用和帽結合作用［20，21］。

流感病毒基因組是由分節段的RNA組成，這種結構特點導致了基因組的易變性和抗原的多變性，例如抗原轉換。A型流感病毒可以通過抗原轉換從其他不同亞型的流感毒株中獲得 HA，也可能獲得NA，這樣的片段重組可以發生在感染了不同的人和動物流感病毒的細胞中。這樣的病毒完全可以編碼新型的抗原蛋白。如果人群對于通過抗原轉換機制產生的新病毒易感并缺乏免疫的時候，流感的大流行就可能爆發。1918—1919年的“西班牙”H1N1流感病毒就可能是通過抗原轉換機制產生的，對于現代社會來說，由其引起的大流感所導致的死亡率是空前的。通過對重新改造的1918流感病毒的特征分析，研究者指出HA、NA和PB1基因都和高致病性有關［22，23］。據此，病毒獲得新的表面抗原有可能導致流感的大流行，并對易感人群和缺乏免疫能力的人群造成嚴重后果。

3 流感病毒的復制

3.1 病毒的吸附

流感病毒可以識別宿主細胞表面的 N-乙酰神經氨酸酶(唾液酸)，它是一種酸性九碳單糖，廣泛存在于N-糖鏈和O-糖鏈末端。唾液酸末端2-C上的羥基能結合3-C或6-C上的半乳糖，形成 α-2，3或α-2，6糖苷鍵，這些不同的糖苷鍵使得唾液酸末端產生獨特的空間結構。病毒表面的HA蛋白可以識別并結合這些唾液酸結構，最常見的是 SAα-2，3Gal和SAα-2，6Gal(N-乙酰基Neu5Ac和N-乙酰基Neu5Gc常簡稱SA)。人類的支氣管上皮細胞主要是SAα-2，6Gal連接，而禽類主要是 SAα-2，3Gal連接;人類的呼吸道上皮細胞也存在少量的 SAα-2，3Gal連接形式的唾液酸，正因為如此，人類和其他靈長類動物也可以被禽流感病毒感染。

在哺乳動物呼吸道上，差異表達的唾液酸受體有助于我們理解禽流感病毒在哺乳動物上的低感染率和高致病性。人類呼吸道上皮細胞含有少量SAα-2，3Gal連接形式的唾液酸，它主要存在于下呼吸道(細支氣管和肺泡)，相比上呼吸道而言，病毒粒子更難達到下呼吸道，因此，人類相對不容易感染禽流感;但是，一旦病毒到達下呼吸道的上皮細胞，人類機體就會產生嚴重的、急性進展性肺炎，病死率高達60%［24］。

HA分子的晶體結構是一個三聚體，具有兩個明顯的結構區域:一個是莖部結構，含有一個三聯的α-螺旋;另一個是球形的頭部，含有反向平行的 β-折疊。頭部含有唾液酸結合位點，在其周圍是可變的抗原決定簇。在病毒復制過程中，HA蛋白被絲氨酸蛋白酶裂解為兩個以二硫鍵相連的亞單位——HA1和HA2，這種翻譯后的蛋白質修飾是病毒感染的必要條件。HA2蛋白的N末端介導病毒外膜與細胞膜融合，而HA1蛋白包含受體結合位點和抗原位點。針對HA的抗體可以中和病毒，因此病毒株在抗原位點頻繁改變氨基酸序列;然而，HA分子的“莖-頭結構”在各亞型和毒株中是保守的。這種在氨基酸序列上的少量變化稱為抗原漂移，實際上，多個抗原位點的突變往往會使病毒逃逸宿主的抗體中和反應，而對于突變的毒株，宿主也變得易感。

3.2 病毒的侵入

隨著流感病毒的HA蛋白(或者是C型流感病毒的HEF蛋白)結合唾液酸，病毒被宿主細胞內吞。吞噬泡中的酸度對于病毒脫衣殼是至關重要的，病毒膜上M2蛋白的離子通道可以使吞噬泡的 pH逐步下降。當pH降至5.0～6.0時，HA2蛋白的結構發生改變;位于HA2蛋白氨基末端的融合肽移位，進而激活融合過程，致使病毒的雙層類脂膜與細胞膜融合，釋放出病毒顆粒內部的 RNPs到宿主細胞漿［25］。M2蛋白是一個跨膜的離子通道，僅在 A型流感病毒中被發現，它有一部分延伸到病毒外膜表面。

3.3 病毒基因組RNA的合成

RNPs從病毒粒子釋放到宿主細胞漿中后，通過核定位信號(NLSs)進入細胞核，這個過程中，NLSs指導宿主細胞蛋白攜帶RNPs和病毒其他蛋白進入細胞核。病毒基因組 RNA的合成在細胞核中進行——加帽和 mRNA的多聚腺苷酸化。病毒的RNA聚合酶利用負鏈的vRNA作為模板合成兩種正鏈RNA——mRNA和cRNA，其中cRNA作為模板，在RNA聚合酶作用下，合成更多的病毒基因組vRNA(圖2)，但mRNA不是全長vRNA的復制品。mRNA轉錄在病毒繁殖周期的早期階段進行，cRNA及vRNA的合成則在中、晚期階段。

圖2 A型流感病毒基因組的復制和轉錄Fig.2 Replication and transcription of influenza A virus

宿主細胞mRNA的多聚腺苷酸化是通過特異的腺苷酸化酶完成的，與之不同的是，病毒 mRNA的腺苷酸尾是由負鏈的vRNA上連續的5-7個尿嘧啶轉錄形成的。病毒各個信使RNA(mRNA)的加帽是以相似的方式完成的:PA(先前認為是PB1)和PB2蛋白“攫取”宿主pre-mRNA轉錄體的5’加帽引物，并進而啟動病毒mRNA合成，這個過程被稱作“cap snatching”。

一旦完成了多聚腺苷酸化和加帽，病毒的mRNA出核，進入細胞質，并像宿主細胞中的mRNA一樣進行翻譯。病毒vRNA片段的核輸出是由病毒的M1蛋白和 NS2蛋白介導的。M1蛋白可以與vRNA和 NP蛋白相作用，同時，也與核輸出蛋白NS2作用;由此，核輸出蛋白NS2介導M1-RNP以核蛋白形式出核進入宿主細胞質。

3.4 RNA的包裝和病毒粒子的組裝

流感病毒并不是都具有感染性，除非它的病毒粒子包含全部八條RNA基因組片段，對于C型流感病毒是七條RNA片段。之前，vRNA的包裝被認為是一個完全隨機的過程，在這種模式下，vRNA片段隨機整合到出芽的病毒粒子中，直到具有完整的基因組片段并具備感染性;然而，最新的研究表明vRNA的包裝是一個選擇的過程，在這種模式下，所有vRNA片段上不連續的包裝信號使得全部的基因組被整合到大部分病毒粒子中，研究者以NA vRNA為例子，發現病毒的vRNA編碼區的3’末端和5’末端對于選擇性整合是至關重要的，尤其是編碼區的3’末端［26］。

3.5 病毒的出芽和釋放

流感病毒的出芽發生在宿主細胞膜上，并可能由位于脂質雙層胞質面的M1基質蛋白所啟動。當出芽完成時，HA突起(HA spikes)不斷使病毒粒子結合到宿主細胞表面的唾液酸，直到NA蛋白發揮分解唾液酸作用后，病毒粒子才被釋放。NA蛋白是一個蘑菇狀的四聚體，通過一個跨膜結構域鑲嵌在宿主細胞表面，它具有破壞受體功能，切斷細胞表面糖蛋白和神經節苷脂的唾液酸末端殘基，從而釋放子代病毒。在病毒包膜上，NA蛋白也移除自身的唾液酸殘基，這樣可以防止病毒粒子聚集，提高感染能力。NA蛋白也可以破壞呼吸道分泌的粘液，允許病毒侵入呼吸道上皮細胞，從而增強病毒的感染能力［27］。

4 易感宿主

A型流感病毒除了可以感染人以外，還感染禽、豬、虎、貓等大約20種以上的物種。其中，H1N1、H2N2和H3N2亞型主要感染人和其它哺乳動物，H5N1、H7N7和H9N2亞型主要感染禽類，其它亞型A型流感病毒感染禽類也有不同程度的報道。B型和C型流感病毒沒有進一步的亞型劃分，B型流感病毒基因結構型與A型相似，但只感染人和海豹且致病性較低，C型流感病毒只是散發存在，可引起人和豬輕微的感染。A型禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)可以感染許多種類的家禽、野禽、特禽、觀賞鳥以及哺乳動物［28，29］，家禽中雞、火雞、鴨、鵝是自然條件下最易感的禽種。鳥類也是 AIV的重要宿主，國外報道已發現帶毒的鳥類達88種之多，我國在17種野鳥中發現禽流感病毒，據調查認為我國青海發生的禽流感是由候鳥斑頭雁引起的［30］。哺乳動物中的豬、馬、海豹以及鯨也是禽流感病毒重要的儲存宿主。人類對禽流感病毒易感性尚不明晰，一般人對禽流感病毒普遍缺乏抗體、無抵抗力。感染豬的 A型流感病毒主要包括 H1N1、H1N2和H3N2亞型，另外豬被認為是流感病毒的混合器，所以可能還有其他亞型A型流感病毒存在豬體內，例如，2009甲型 H1N1病毒就是豬體內同時存在了人、禽和豬三種流感病毒后基因重組而成。

5 結語

流感病毒亞型眾多，毒力差異大，從 A型病毒的分子生物學研究來看，由于基因分節段性和RNA聚合酶的無校正性，使得A型流感病毒容易發生抗原轉換和抗原漂移。不同宿主的流感病毒頻繁變異和重組，極易產生新的流行株，一旦獲得人傳人能力及高致病性片段和突變，將會引起全球范圍的大流行。

傳統觀點認為，AIV不直接感染人，主要通過在中間宿主(豬)體內與禽、人流感病毒進行基因片段重組獲得識別人流感病毒受體能力而對人致病。從最新的一些實驗結果可以看出，人類呼吸道內也存在AIV的受體，而且，AIV可以通過遺傳變異不斷提高受體結合能力，所以AIV也能夠直接感染人呼吸道，然后在其體內進化而提高其復制能力并獲得對人的致病性。2009年 3月在墨西哥爆發的甲型H1N1流感就是由一種通過抗原轉換機制獲得豬、禽和人流感病毒片段的豬流感病毒引起的，由于其獲得人傳人能力和高致病性，迅速在全球蔓延并導致上百人死亡。截止2009年11月，全球已感染20萬，死亡6000多人，其中美洲確診病例190，765例，死亡4512人［31］。我國截止2009年12月13日，31個省份報告甲型H1N1流感確診病例7949例，住院治療2502例，死亡116人［32］。

雖然在流感病毒的分子生物學的研究取得很多成果，闡明了其復制和致病能力的分子機理，但是流感病毒復制和毒力變化的深層機制還不十分清楚，尤其是流感病毒與宿主之間的作用機理。對流感病毒，尤其是A型流感病毒的分子生物學的研究還需要各國科學家通力合作，闡明其變異和致病的原理，這也必將為流感疫苗的研制和新型藥物的開發提供理論基礎和技術支持。

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Advances in Research on Molecular Biology of Influenza Virus

ZHANG Wei1，2，WANG Cheng-yu2，YANG Song-tao2，GAO Yu-wei2，XIA Xian-zhu1，2*
(1.Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College(PUMC);Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)，Beijing 100021，China; 2.Veterinary Institute，Academy of Military Medical Sciences，Changchun 130062，China)

Influenza virus，a member of the Orthomyxoviridae family，is an enveloped RNA virus with a genome in the form of eight segments requiring an RNA dependent RNA polymerase of viral origin for replication.Influenza viruses can escape the long-term neutralizing antibody response in many hosts via ever-changing antigenic shift and antigenic drift resulting from the particular structure of the virus genome and function of its viral proteins.In this paper，the structure of virus，the genome and encoding proteins of virus，the replication process and susceptible hosts will be summarized.

Influenza virus;RNA virus;Antigenic shift;Antigenic drift

R-33

A

1671-7856(2010)04-0074-06

2009-10-30

國家科技支撐計劃項目(No.2010BAD04B01)。

張偉(1978－)，男，博士，主要從事禽流感防治方面的研究。E-mail:wisherzhw2007@163.com。

夏咸柱，教授，E-mail:xia_xzh@yahoo.com.cn。