大慶油田油藏微生物基因組DNA的提取與分析

任國領(lǐng),袁紅梅,侯兆偉,卞立紅,黃永紅

(1.大慶師范學院生命科學學院,黑龍江大慶 163712; 2.大慶油田有限責任公司勘探開發(fā)研究院,黑龍江大慶163712)

大慶油田油藏微生物基因組DNA的提取與分析

任國領(lǐng)1,袁紅梅1,侯兆偉2,卞立紅1,黃永紅1

(1.大慶師范學院生命科學學院,黑龍江大慶 163712; 2.大慶油田有限責任公司勘探開發(fā)研究院,黑龍江大慶163712)

16SrDNA基因克隆文庫的建立和DGGE(變性梯度凝膠電泳)是分析油藏微生物群落結(jié)構(gòu)和種群動態(tài)變化的重要方法,油藏微生物基因組DNA的提取是進行16SrDNA基因克隆文庫的建立和DGGE的前提.建立大慶油田油藏微生物基因組DNA提取的方法,與基于SDS細胞裂解法相比,華舜基因組抽提試劑盒法具有DNA濃度高、純度好和省時等優(yōu)點.不同油藏條件下的實驗和PCR擴增技術(shù)分析結(jié)果表明:該方法能夠成功提取基因組DNA,并且提取的基因組DNA可以直接用于克隆文庫和DGGE實驗的細菌16SrDNAPCR擴增.這說明DGGE與分子克隆相結(jié)合的分子生物學方法在研究微生物提高原油采收率(MEOR)機理及指導MEOR在油田生產(chǎn)中的應(yīng)用有著重要意義.

油藏微生物;基因組DNA;16SrDNA;PCR擴增

0 引言

微生物能通過自身的有益活動及其代謝產(chǎn)物提高原油采收率(MicrobialEnhancedOilRecovery, MEOR).人們利用菌種分離的技術(shù)進行可培養(yǎng)采油微生物的分離純化,已從油藏中分離出硫酸鹽還原菌、產(chǎn)硫化物菌、硫氧化細菌、發(fā)酵細菌、錳和鐵還原菌、產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)乙酸鹽菌,以及烴氧化菌、腐生菌、產(chǎn)多糖菌、產(chǎn)生物表面活性劑菌等[1-5].由于可培養(yǎng)微生物僅占自然界微生物中很小的一部分,傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)只能反映很少量的微生物群落結(jié)構(gòu)特征[6].隨著分子生物學的發(fā)展和進步,尤其是基于16SrDNA克隆文庫、DGGE(變性梯度凝膠電泳)、熒光原位雜交和基因芯片[7-10]等一些具有特色的技術(shù)手段,應(yīng)用到油藏微生物群落結(jié)構(gòu)和種群動態(tài)研究中,使人們更加全面、客觀、及時、準確認識油藏微生物群落結(jié)構(gòu)和種群動態(tài)變化規(guī)律,可以從分子水平上揭示油藏微生物的多樣性,促進對油藏微生物多樣性的認識,并深刻影響微生物采油機理研究和應(yīng)用方向[11].

油藏微生物基因組DNA的提取是進行16SrDNA克隆文庫的建立和DGGE、熒光原位雜交和基因芯片等實驗的前提和關(guān)鍵.基因組DNA的濃度和純度影響后續(xù)的PCR擴增、雜交、內(nèi)切酶酶切等分子生物學實驗[12].筆者建立大慶油田油藏微生物基因組DNA提取的方法,與常規(guī)的提取方法——基于SDS細胞裂解方法相比,該方法具有DNA濃度大、純度高和省時等優(yōu)點,不同油藏環(huán)境中的驗證結(jié)果表明,該方法成功地提取到基因組DNA.PCR擴增技術(shù)分析結(jié)果表明,提取的基因組DNA可以直接用于16S rDNA克隆文庫的建立和DGGE.一方面,利用克隆文庫和DGGE分析油藏中微生物群落組成結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢種群,分析主要的采油功能菌,為微生物提高原油采收率(MEOR)菌群的選擇提供指導;另一方面,利用克隆文庫和DGGE分析微生物提高原油采收率(MEOR)過程中油藏微生物的動態(tài)演替規(guī)律,為微生物提高原油采收率(MEOR)提供分子生物學指導.這些微生物分子生態(tài)學的應(yīng)用為確定油藏微生物提高原油采收率(MEOR)技術(shù)的可行性、定向調(diào)控油藏微生物群落、開發(fā)和應(yīng)用微生物提高原油采收率(MEOR)提供依據(jù).因此,油藏微生物基因組DNA的提取可為油藏微生物群落結(jié)構(gòu)和種群動態(tài)變化規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ),從而有效指導微生物提高原油采收率(MEOR)技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用.

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 油藏微生物樣品

樣品取自大慶油田聚驅(qū)油藏典型區(qū)塊,大慶第一采油廠、大慶第三采油廠;水驅(qū)油藏區(qū)塊,大慶第二采油廠;低滲透油藏區(qū)塊,大慶第十采油廠.

1.1.2 試劑和儀器

華舜基因組抽提試劑盒(上海華舜生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))、PCR試劑(Takara公司生產(chǎn))、PCR擴增儀(bio-rad公司生產(chǎn))、DNA瓊脂糖電泳儀(bio-rad公司生產(chǎn))、凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司生產(chǎn))、紫外分光光度儀(美國Thermo公司生產(chǎn))、其他試劑(寶泰克公司生產(chǎn)).

1.2 樣品處理和基因組DNA提取

1.2.1 樣品處理

在無菌條件下,取500mL油井采出液樣品,用定性濾紙過濾除去樣品中的懸浮顆粒,收集濾液,于10000r/min離心得到菌體;用5mL無菌PBS緩沖液洗菌體3次,離心收集用于基因組的提取.

1.2.2 基因組DNA提取

(1)基于SDS的細胞裂解法.參照ZhouJ等[13]的方法略加修改,樣品中加入300μLDNA提取液(100mmol/LTris-HCl,100mmol/LNa-EDTA,100mmol/L磷酸鈉,115mol/LNaCl,1%CTAB(質(zhì)量分數(shù),下同),pH=8.0和5μL蛋白酶K10mg/mL),于37℃下225r/min搖0.5～1.0h.加入50μL的20%SDS,65℃水浴2h,每間隔5～10min輕搖1次;于室溫6000r/min離心10min,取上清液;沉淀中加入100μLDNA提取液、20μL的20%SDS,漩渦振蕩30s,65℃水浴10min,離心10min,取上清液,重復3次;將3次上清均勻混合;用等體積的Tris-飽和酚抽提2次,酚加氯仿加異戊醇和氯仿加異戊醇各抽提1次,以0.6倍體積的異丙醇于室溫沉淀DNA,13000r/min離心30min,70%乙醇洗滌沉淀, DNA沉淀干燥后溶于60μLTE緩沖液中.

(2)按華舜基因組抽提試劑盒說明書提取基因組DNA.提取的基因組DNA,一部分用于DNA分光光度檢測;另一部分用于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測;其余部分置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.3 DNA提取分析

1.3.1 濃度和純度

用紫外分光光度儀測定DNA,粗提液在260、280nm處的吸光度[14].DNA濃度(ng/μL)和純度計算:DNA濃度=50×OD260;DNA純度=OD260/OD280.

1.3.2 16SrDNAPCR擴增

從油藏微生物基因組DNA擴增用于DGGE的16SrDNA引物和擴增片段長度參照王君和刑德峰等[15-16]方法(見表1). PCR擴增反應(yīng)體系:0.5μL模板,12.5μLPremixTaqVERSION,0.5μL正向引物(25 mmol/L),0.5μL反向引物(25 mmol/μL)和適量超純水(補足25μL).PCR擴增反應(yīng)采用TouchDownPCR方法[17],條件:95℃預(yù)變性5min,循環(huán)過程:94℃,30s;退火溫度,30s;72℃,1min(其中退火溫度從50～64℃,每個溫度3個循環(huán));之后再進行16個循環(huán)(94℃,30s;54℃,退火30s;72℃,1min);72℃,延伸10min.PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

從油藏微生物基因組DNA擴增用于克隆文庫的16SrDNA引物一般為細菌16SrDNA通用引物為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′[18],擴增產(chǎn)物片段長約1400bp.PCR擴增反應(yīng)體系[19]:0.5μL模板,12.5μLPremixTaqVERSION,0.5μL正向引物(25mmol/L),0.5μL反向引物(25mmol/μL)和適量超純水(補足25μL).PCR擴增反應(yīng)條件:95℃,預(yù)變性5min,循環(huán)過程:94℃,1.5min;54℃,1.5min;72℃,3min,32個循環(huán);72℃,延伸10 min.PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

表1 16SrDNA的PCR擴增引物

2 DNA提取及16SrDNAPCR擴增

2.1 提取方法

基于SDS細胞裂解法和華舜基因組抽提試劑盒法[20]分別提取大慶第三采油廠油井采出液基因組DNA,提取的基因組DNA濃度分別為14.2,27.8ng/μL,純度分別為1.64,1. 75.華舜基因組抽提試劑盒法提取的基因組DNA濃度明顯大于SDS細胞裂解法提取的,并且DNA純度處于標準范圍(1.7～1.8),而SDS細胞裂解法提取的基因組DNA中可能含有一定的蛋白質(zhì)或者酚等雜質(zhì),其純度小于1.7.瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,華舜基因組抽提試劑盒法提取的基因組DNA條帶亮度明顯大于基于SDS細胞裂解法提取的(見圖1),基于SDS細胞裂解法提取基因組DNA需要的時間是華舜基因組抽提試劑盒法提取基因組DNA的2倍.結(jié)果表明,華舜基因組抽提試劑盒法提取的油藏微生物基因組DNA具有DNA濃度大、純度好,并且省時等優(yōu)點.實驗選取華舜基因組抽提試劑盒法提取油藏微生物基因組DNA.

圖1 油井采出液樣品基因組DNA的凝膠電泳圖譜

2.2 DNA提取

分別用基因組抽提試劑盒法提取大慶第一采油廠、第三采油廠聚驅(qū)油藏典型區(qū)塊和大慶第二采油廠水驅(qū)油藏區(qū)塊,以及大慶第十采油廠低滲透油藏區(qū)塊油井采出液微生物基因組DNA(見圖2,圖2(a)中M為λDNA/HindMarker,圖2(b)中M為λDNA/HindMarker,圖2(c)中M為λDNA/HindⅢMarker).基因組抽提試劑盒法可以從聚驅(qū)油藏典型區(qū)塊和水驅(qū)油藏典型區(qū)塊,以及低滲透油藏處能提取到濃度不等的基因組DNA,表明基因組抽提試劑盒法適合不同油藏條件下微生物基因組DNA的提取.

2.3 16SrDNAPCR擴增

用基因組抽提試劑盒法提取的基因組DNA通過PCR直接擴增出細菌16SrDNA用于克隆文庫的構(gòu)建和DGGE(見圖3),該基因組抽提試劑盒法提取的基因組DNA能夠滿足后續(xù)實驗操作.

圖2 不同油藏條件下油井采出液樣品基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳

3 結(jié)果與討論

由于油藏及其微生物具有復雜性和多樣性,利用傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)的方法研究微生物提高原油采收率的機理,進而指導微生物采油的現(xiàn)場應(yīng)用已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代油藏微生物研究的需要.利用分子生物學和基因工程等手段,從油藏微生物基因組DNA的角度研究油藏微生物的多樣性及功能是廣泛采用的技術(shù)方法,并且已經(jīng)得到一些應(yīng)用.DGGE與分子克隆相結(jié)合的分子生物學方法在研究微生物提高原油采收率(MEOR)機理,以及指導MEOR在油田生產(chǎn)中的應(yīng)用有著重要的意義.

油藏微生物基因組DNA的提取是進行分子生物學和基因工程研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵. SDS細胞裂解法和華舜基因組抽提試劑盒法相比,后者具有DNA濃度大、純度好,并且省時等優(yōu)點.在不同油藏條件和不同采油廠進行基因組DNA提取的驗證.結(jié)果表明,該基因組DNA提取方法能夠適合不同油藏條件下微生物基因組總DNA的提取.由于不同油藏條件和油井存在差異,提取的基因組DNA濃度有一定的差異.這說明在不同油藏和不同油井條件下微生物存在相對含量和菌群結(jié)構(gòu)的差異,有必要進行微生物群落分析.

基因組DNA的濃度和純度直接影響后續(xù)的PCR擴增、雜交、內(nèi)切酶酶切[21]等分子生物學實驗,該實驗是檢驗基因組DNA提取方法的標準.16SrDNA克隆文庫和DGGE等技術(shù)是研究微生物提高原油采收率(MEOR)過程中油藏微生物群落組成結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢種群及菌群動態(tài)演替規(guī)律的主要手段.華舜基因組抽提試劑盒法提取基因組DNA能夠很好滿足16SrDNA克隆文庫的建立和DGGE分析,這也為微生物提高原油采收率(MEOR)技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用做好鋪墊.

圖3 不同引物PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜

4 結(jié)論

(1)與傳統(tǒng)的基于SDS細胞裂解法提取油藏微生物相比,華舜基因組抽提試劑盒法提取油藏基因組DNA具有DNA濃度大、純度高和省時等優(yōu)點.

(2)在大慶油田聚驅(qū)油藏典型區(qū)塊、水驅(qū)油藏區(qū)塊和低滲透油藏區(qū)塊油藏采出液中使用華舜基因組抽提試劑盒法提取基因組DNA均能得到很好的效果.

(3)華舜基因組抽提試劑盒法提取基因組DNA能夠直接用于克隆文庫和DGGE實驗的細菌16SrDNAPCR擴增,并且擴增效果良好.

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Genomic DNA extraction and analysis of oil reservoir microorganism in Daqing oilf ields/ 2010 ,34( 4) :89 -93

REN Guo-ling1,YUAN Hong-mei1,HOU Zhao-wei2,BIAN Li-hong1,HUANG Yong-hong1
(1.Col lege of Life Sciences , Daqing Normal University , Daqi ng , Hei long jiang 163712 , China; 2.Ex ploration and Development Insti tute , Daqing Oil field Co. Ltd , Daqing , Hei long jiang 163712 ,Chi na ))

16S rDNA gene cloning library and Denaturing Gradient Gel Elecrop horesis (DGGE) are twokinds of important methods with which we study microbial community structure and dynamics change.These experimental methods must be based on genomic DNA extraction of oil reservoirs microorganism.We have successfully established genomic DNA extraction method of oil reservoirs microorganism inDaqing Oilfield. Compared with SDS - based DNA extraction method , our method has some advantagesincluding more DNA concent ration , higher DNA purity , time saving and soon. We all could successf ullyext ract genomic DNA on different oil reservoirs by the method. Besides , extraction genomic DNAmay directly carry on bacterium 16S rDNA PCR amplification which can be used in gene clone library andDenat uring Gradient Gel Elecrop horesis (DGGE) . DGGE followed by molecular cloning technique is apracticable protocol to research the mechanism of Microbial Enhanced Oil Recovery (MEOR) and applyMEOR in practical oil production in Daqing Oil Field.

oil reservoir s microorganism ; genomic DNA ; 16S rDNA ; PCR amplification

book=4,ebook=344

TE357

A

1000-1891(2010)04-0089-05

2010-03-10;審稿人:劉慶旺;編輯:任志平

黑龍江省科技攻關(guān)項目(GZ05A406);大慶油田有限責任公司科技項目(dqc-2009-cc-ky001)

任國領(lǐng)(1980-),男,博士,講師,主要從事微生物采油技術(shù)方面的研究.