黃芩藥材的毛細管電泳指紋圖譜研究

王麗聰，曹玉華

（1.江陰職業技術學院化紡系，江蘇 江陰 214431；2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214036）

黃芩藥材的毛細管電泳指紋圖譜研究

王麗聰1，曹玉華2

（1.江陰職業技術學院化紡系，江蘇 江陰 214431；2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214036）

采用毛細管電泳方法建立黃芩不同產地藥材的指紋圖譜。考查多種提取方法提取黃芩藥材中黃芩苷的提取率；研究運行緩沖液的濃度和酸度、檢測波長及分離電壓對黃芩藥材指紋圖譜的影響，得到了優化的測定條件（50mmol/L硼砂緩沖液，pH值7.94，分離電壓為20kV,柱上254nm紫外檢測）。進行精密度和重現性實驗，各共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于5%。最后利用相似度和聚類分析兩種方法對10批黃芩藥材的毛細管電泳指紋圖譜進行分析，結果與實際樣品分類相符合。

毛細管電泳；指紋圖譜；黃芩

目前，色譜法尤其是高效液相色譜法（HPLC）是中藥指紋圖譜研究最常用方法。但用HPLC進行中藥成分分析常遇到一些問題。如色譜柱易受污染，柱壽命短且難以再生，分析運行成本高且費時長。毛細管電泳具有分離效率高、分析速度快、試劑用量少和成本低等優點[1，2]，運用高效毛細管電泳（HPCE）方法對黃芩藥材的指紋圖譜進行研究，作者還未見報道。本研究運用HPCE方法建立黃芩藥材指紋圖譜，并對10批藥材的指紋圖譜進行了分析比較，為黃芩藥材的質量評估提供了一定的科學依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效毛細管電泳系統(CAPEL 105,俄羅斯),配有紫外檢測器；超聲波振蕩器(BRANSON SB3200-T,上海)；微波爐（松下變頻）；石英毛細管(有效長度: 52 cm,內徑:50μm,Polymicro Technologies,USA)。HW-2000色譜工作站（上海千譜軟件有限公司，上海）。

所用藥材樣品山西黃芩（1#）、內蒙黃芩（2#）、滇黃芩（家種3#）、滇黃芩（野生4#）均由洛陽高新開發區陸生天然植物研究所王忠東教授提供并鑒定，其余河北黃芩5-10#為市售。所用試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 供試品溶液的制備

精確稱取黃芩粉末試樣約0．1g，加入水10mL，微波提取40s，離心，吸取上層清夜，經0．45μm濾膜過濾，即得黃芩樣品溶液。

1.3 實驗方法

運行緩沖液為50mmol/L的硼砂緩沖溶液（pH= 7．94），所有溶液使用前均用0．45μm聚丙稀濾膜過濾，測定溫度20℃，分離電壓20kV，檢測波長254nm，30 mb壓力進樣，進樣時間10s。實驗前，依次用0．1mol/L的NaOH、水、運行緩沖液分別沖洗10、4、20min，兩次進樣間用緩沖液在20kV電壓下沖洗5min。

2 結果與討論

2.1 樣品溶液的制備

實驗中曾采用各種提取方法，包括：不同比例醇提、水提、超聲醇提、超聲水提及微波提取。黃芩苷含量一般作為黃芩藥材的質量控制指標。以考查各種提取方法的提取率，將提取液中黃芩苷的含量作為選擇提取方法依據之一,結果如表1所示（表中方法1～4依次表示25%，50%，75%，100%乙醇超聲波提取30min；方法5為水煎煮30min；方法6為水超聲波提取30min；方法7～10表示依次25%，50%，75%，100%乙醇回流提取30min；方法11為微波提取40s）。結果可知，微波提取40s與75%乙醇回流提取30min所得黃芩苷的提取率最高。其次,根據指紋圖譜的特性，我們考察各種提取方法所得電泳圖中峰的個數，發現各譜圖中峰個數依次為微波提取40s＞75%乙醇回流提取30min＞水煎煮30min＞水超聲波提取30min＞乙醇超聲波提取30min。綜合以上兩點的考察,我們確定微波提取40s為黃芩毛細管電泳指紋圖譜的最佳提取方法。同時，微波提取還具有簡便、省時等優點。

表1 不同提取方法所得黃芩苷含量

2.2 電泳條件

由于硼砂與黃酮類化合物發生螯合反應可以增大被測組分的溶解度，所以選擇硼砂溶液作為緩沖液。運行緩沖液的pH值是影響電滲流和各分離組分電泳淌度的最重要因素。考查了pH值6～10范圍對電泳分離的影響發現，當pH值大于8．5時，圖（1）中前兩個大峰均為混合峰，沒有得到分離；且pH值越高，黃酮類物質越易氧化，測定的重現性不能得到保證。當pH值小于7．7時，圖(2)中最大的峰為混合峰，沒有得到分離。而pH值在7．7～8．2之間，各峰基本分離，見圖（3）。因此，選擇pH值7．94為最佳運行緩沖液pH值。此外，還考察了不同檢測波長（210，254，278，290nm）及不同分離電壓（15、20、25kV）的影響。從靈敏度、分離度以及電泳峰個數綜合考慮，選擇254nm作為檢測波長，以50mmol/L硼砂（pH=7．94）為運行緩沖液，分離電壓20kV，30mBar下壓力進樣10s的最佳電泳條件。

2.3 指紋圖譜的建立

不同樣品按照1．3方法分別進樣，測定，得各樣品的毛細管電泳指紋圖譜。黃芩樣品的典型電泳圖見圖3。

2.4 方法學考察

儀器精密度實驗：取同一供試品溶液，連續進樣5次，測得共有峰11個，各色譜峰相對保留時間的RSD＜3%，共有峰相對面積的RSD＜5%，表明儀器精密度良好。

重現性實驗：取同一樣品5份，按1．2條方法制備供試品溶液，分別進樣，測得各色譜峰相對保留時間RSD＜4%，共有峰相對面積的RSD＜5%，表明方法重現性良好。

穩定性實驗：取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、12、24h進樣，各色譜峰相對保留時間的RSD＜5%，色譜峰相對峰面積的RSD＜5%，表明供試品溶液在24h之內穩定。

2.5 指紋圖譜各項技術參數

2.5.1 相似度計算

采用工作站計算軟件，對10批藥材指紋圖譜進行重疊，各批樣品相應色譜峰大體重疊，符合匹配要求。匹配后產生11個共有電泳峰，以6號峰作為參照物，計算10批樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表2和表3。以供試品的各峰平均值為對照模板，利用Excel 2002軟件[3]，采用夾角余弦和相關系數的方法來計算黃芩指紋圖譜相對保留時間和相對峰面積的相似度。結果如表3和表4中第12、13行所示。

表2 樣品的CE指紋圖譜色譜峰的相對保留時間

表3 樣品CE指紋圖譜色譜峰相對面積值

2.5.2 系統聚類分析

各色譜峰的相對峰面積值見表3，以相對峰面積值為變量，利用SAS軟件中最小距離法進行聚類分析，結果將10個樣品分為五類，如圖4所示。

2.5.3 結果分析

相似度計算結果表明,5個產地黃芩藥材的指紋圖譜的圖貌基本一致,但各共有峰的相對峰面積有所不同。從表3可以看出，除了3＃～4＃滇黃芩外其他樣品的指紋圖譜的相似系數均大于0．985，即滇黃芩與其他樣品間的差異較明顯，5#～10#為相同產地，樣品指紋圖譜的相似系數沒有明顯差異。聚類分析樹形圖表明，10批樣品分為5類，5#～10#為最小距離，分為一類，而1#～4#各分為一類，這與事實相符合。這些都表明黃芩中各成分含量的差異與其生長環境密切相關，不同產地，峰面積比值有較大差異。因此，本研究結果從一定程度上表明指紋圖譜是控制藥材內在質量的有效手段。

［1］ 曹玉華，汪云．毛細管電泳電化學檢測法測定胡黃連中香草酸和阿魏酸的含量[J]．分析測試學報,2003,22(6):95-97．

［2］ 劉保啟，胡孝忠，王玉春，等．高效毛細管電泳法測定姜黃中姜黃素類化合物[J]．分析測試學報,2004，23(1):109-111．

［3］ 苗愛東，孫殿甲．Excel 2002在中藥指紋相似度計算中的應用[J]．藥學進展,2003,27(1):51-54

Study on the fingerprints of radix scutelariae by HPCE

WANG Li-cong1,CAO Yu-hua2
(1.Department of Chemical Engineering,Jiangyin Polytechnic College,Jiangsu Jiangyin,214431; 2.School of Chemical and Material Engineering,Southern Yangtze University,Jiangsu Wuxi 214036)

A method based on high performance capillary electrophoresis(HPCE)to establish the fingerprint of Radix Scutelariae was described.The contents of Baicalin in Radix Scutelariae extraction with various kinds of extraction methods were determined to choose appropriate extraction method.The effects of concentration and acidity of running buffer,UV detection wavelength and applied voltage were investigated.The optimum conditions were a 50mmol/L borax buffer(pH7.94)as the running buffer,separation voltage of 20kV and 254nm as detection wavelength.This proposed method demonstrated good stability and reproducibility with RSD less than 5%for both the relative retention time and the relative areas.Finally,the data of fingerprints of 10 batches of Radix Scutelariae were processed with two different mathematic methods of similitude coefficient and the SAS system,and the results of both methods were consistent with the facts.

capillary zone electrophoresis;radix scutelariae;fingerprints

book=2010,ebook=185

10.3969/j.issn.1008-1267.2010.04.009

TQ657.8

A

1008-1267（2010）04-024-04

2010-03-10

王麗聰（1979-），女，山西汾陽人，碩士，研究方向為中藥分析。