濁度法測定四環素片效價的可行性研究

彭素梅 李洪波

四環素是從放線菌金色鏈叢菌(streptomyces aureofaciens)的培養液等分離出來的抗菌物質，對革蘭陽性菌、陰性菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體屬乃至原蟲類都有很好的抑制作用，是一種廣譜抗菌素。對于四環素效價的測定，《中國藥典))2005年版采用管碟法［1］。管碟法操作繁瑣，耗費時間長，影響因素多，重現性差，采用濁度法測定可克服以上不足［2］。本文建立了利用濁度法測定四環素片效價的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 WBS-100全自動微生物比濁法測定儀及石英培養杯(北京先驅威鋒技術開發公司)，R200D電子天平(德國Sartorius公司)。

1.2 菌株、樣品、培養基及試劑 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］由中國藥品生物制品檢定所提供;四環素標準品(批號:130306-200317，970 μg/mg)由中國藥品生物制品檢定所提供;四環素片(批號:0806007;0808011;0810012)由北京康蒂尼藥業有限公司提供。

抗生素檢定培養基Ⅱ號(pH6.5，批號070603)由北京三藥科技開發公司提供;抗生素檢定培養基Ⅲ號(pH7.0，批號070105)由北京三藥科技開發公司提供;滅菌0.9%氯化鈉溶液和磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)均按中國藥典2005年版二部附錄3配制。其他試劑均為分析醇。

2 實驗方法

2.1 菌液的配制取 金黃色葡萄球菌斜面培養物，接種于營養瓊脂斜面上，置35℃ ～37℃培養18～22 h，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，加生理鹽水稀釋，使其在530 nm波長處的吸光度約為1.0。取菌液0.3 ml加至100 ml抗生素檢定培養基Ⅲ中，搖勻，為實驗菌液。

2.2 標準品貯備溶液的配制 精密稱取四環素標準品26.20 mg，置25 ml量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容，作為標準品貯備液。用磷酸鹽緩沖溶渡(pH6.0)按劑距比 1.5∶1 進一步稀釋成 0.06、0.09、0.13、0.2、0.3 μg/ml的標準品溶液。

2.3 供試品溶液的配制 取四環素片樣品10片，研細，精密稱取適量(約相當于紅霉素100 mg)，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解后，室溫密閉放置過液，精密量取上清液，作為供試品貯備溶液。試驗時精密四環素片儲備液適量，用磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)稀釋成0.2和0.1 μg/ml的供試品溶液。

2.4 培養與測定 采用標準曲線法測定。取系列標準品溶液和供試品溶液各1.0 ml，按拉丁方排列分別加入滅菌培養管中，再加入實驗菌液9.0 ml，置微生物比濁法測定儀內，于37℃培養。另取稀釋溶劑1.0 ml，加9.0 ml空白培養基，混勻，作為空白對照。儀器在位于530 nm波長處測定各管金黃色葡萄球菌對數生長期內小同培養時間下的吸光度值(A)。以標準品溶液濃度的對數值為橫坐標，以吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，按標準曲線法汁算供試品的效價值。

3 結果

3.1 線性實驗 在0.05～0.33 μg/ml范圍內做線性實驗。分別精密苗取上述四環素系列標準品溶液各1.0 ml，置滅菌比色皿中，每個濃度5管，分別加入實驗菌液9.0 ml，立即搖勻，置抗生素比濁法測量儀內，于(37±1)℃培養4 h，在530 nm處測定吸收度，計算標準曲線。結果顯示，抗生素濃度在0.06～0.3 μg/ml時，吸光度值A與抗生素濃度對數呈良好的線性關系，回歸方程為Y=bX+a=-0.3002X-0.0316(相關系數r=0.9968)，在此范圍內可設計用標準曲線法測定四環素的含量。

3.2 回收率實驗 分別精密量取四環素標準品加入到已測定濃度的四環素片樣品溶液中，加0.1 mol/L鹽酸溶液配制成濃度為0.08、0.10及0.12 μg/ml混合溶液各3份，按2.4方法測定回收率。平均回收率為99.22%(n=9)，RSD=1.7%。結果見表1。

表1 四環素片加樣回收試驗結果(n=9)

表2 比濁法與管碟法測定四環素效價的結果比較

3.3 與管碟法的比較 取3批四環素片樣品按2.4方法和中國藥典2005年版二部四環素片含量測定項下管碟法測定其效價，將結果進行比較，見表2。

4 討論

中國藥典2005年版二部收載四環素效價測定采用管碟法［1］。管碟法能直觀反應樣品的體外抗菌能力，一直被廣泛應用。但因其操作繁瑣，實驗時間長，影響因素多，濁度法可以克服管碟法的不足，且根據我科室采用兩種方法比較，濁度法與管碟法結果基本一致。

但濁度法也應注意操作的規范性，如菌液培養時間的一致性，主要是使每管的培養時間相等，實驗時在試管中加入含試驗菌液的培養基后，應立即加入標準品溶液和供試品溶液，混合均勻;濁度法對試驗儀器的性能要求較高，主要體現在培養室的溫度偏差，要求培養溫度一致;另外比色管的清潔度也會給測定結果帶來影響。但濁法快速、易于操作，采用液體培養基，消除了多組分抗生素在固體培養基中擴散不同的影響，使得試驗的靈敏度高，精密度和準確度都較瓊脂擴散法好。而且用同定波長測定菌液的吸光度其精密度優于管碟法中對抑菌圈的測定。

［1］國家藥典委員會，中國藥典(二部)．化學工業出版社，2005．

［2］張治錟．抗生素藥品檢驗．人民衛生出版社，1987:80-97．