五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙保護作用的研究*

張長城，賈亮亮，許 佳，孫志偉，曾 曉，何毓敏，袁 丁，王洪武

(三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002)

五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙保護作用的研究*

張長城，賈亮亮，許 佳，孫志偉，曾 曉，何毓敏，袁 丁，王洪武△

(三峽大學醫(yī)學院，湖北 宜昌 443002)

目的:研究五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺(CY)所致小鼠生精障礙的保護作用。方法:腹腔注射環(huán)磷酰胺建立小鼠生精障礙模型，檢測小鼠的睪丸及附睪重量、精子密度、活率，流式細胞術分析睪丸各級生精細胞細胞周期，光、電鏡觀察睪丸組織學和超微結構的變化。結果:五子衍宗湯能夠顯著增加模型小鼠的睪丸及附睪重量，增加精子密度，提高精子活率，恢復各級生精細胞百分比;改善環(huán)磷酰胺所致模型小鼠睪丸組織的病理性變化。結論:五子衍宗湯可以顯著改善環(huán)磷酰胺所致的小鼠生殖功能損害。

五子衍宗湯;環(huán)磷酰胺;生精障礙

五子衍宗湯由枸杞子、菟絲子、五味子、覆盆子、車前子組成，具有補腎益精、填精補髓的功效，主治腎虛遺精、陽痿早泄、久不生育，在臨床上常用于男性不育的治療，但五子衍宗湯是否具有拮抗環(huán)磷酰胺所致生精障礙的藥理作用尚未明確。

1 材料與方法

1.1 藥物

五子衍宗湯由枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子、五味子組成，全部生藥經三峽大學醫(yī)學院汪鋆植教授鑒定為正品。按照傳統(tǒng)方法煎藥，濃縮至粉末，提取率為18.8%，臨用前配成相應濃度的溶液;注射用環(huán)磷酰胺，規(guī)格為0.2g，批號08121021，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.2 動物

BalB/c種雄性小鼠，SPF級，8～9周齡，22g～25g，湖北省實驗動物中心提供，動物生產許可證號SCXK(鄂)2008-0005。

1.3 試劑

Bouins液:苦味酸飽和水溶液 750mL，甲醛250mL，冰醋酸 50mL。精子營養(yǎng)液:BWW(NaCl 0.554 g/L、KCl0.0356 g/L、CaCl20.025g/L、KH2PO40.0162 g/L、MgSO4·7H2O 0.0294 g/L、NaHCO30.210g/L、NaPyr 0.003g/L、Nalac 0.370g/L、Glucose 0.100g/L、質 量 分 數(shù) 0.5% 的 酚 紅1.0mL、青霉素10000U、質量分數(shù)0.3%的 BSA。其余藥品均為分析純。

1.4 儀器

SQIAS-2000彩色精液質量圖文分析儀，武漢千屏影像技術有限責任公司;DMR型多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)，德國Leica公司;H-7500型透射式電子顯微鏡，德國Leica公司;ULTRACUT R型超薄切片機，奧地利萊卡公司;JA2003型電子分析天平，上海天平儀器廠。

1.5 方法

1.5.1 動物模型制備 32只BalB/c雄性小鼠，隨機分為4組，依次為空白對照組、模型組、五子衍宗湯低劑量組、五子衍宗湯高劑量組。除空白對照組外，其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50mg/kg，連續(xù)注射7d，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。空白對照組和模型組每天灌服1%羧甲基纖維素鈉0.2ml，五子衍宗湯低劑量組給予五子衍宗湯2g/kg，五子衍宗湯高劑量組給予五子衍宗湯4g/kg，各組小鼠連續(xù)給藥35d。

1.5.2 小鼠生殖器官重量的測定 末次給藥24h后稱重，處死小鼠取睪丸和附睪并稱濕重。

1.5.3 小鼠精子密度及精子活率的測定 將盛有6ml精子營養(yǎng)液［1］的試管置于恒溫水浴箱預熱至37℃，取單側附睪去除脂肪，剪碎放入試管中搖勻，37℃保溫10min～15min，使精子充分游離，接著取1滴滴入牛鮑氏血細胞計數(shù)板上，計算每毫升精子數(shù)。用微量移液器吸取10μl精子懸液，利用SQIAS-2000彩色精液質量圖文分析儀進行精子活率測定。

1.5.4 小鼠睪丸各倍體生精細胞比例的影響測定 取單側睪丸去除包膜、剪碎，置于3ml pH 7.4的PBS試管中，于漩渦震蕩混合器上混合3min，組織細胞液用200目尼龍網過濾于試管內，1500r/min離心5min，棄上清將沉淀懸浮后加3ml PBS，混勻1min，同樣條件重復洗滌2次，制成單細胞懸液。PBS調整細胞濃度至106～107個/ml 4℃、70%乙醇固定2 h后，低速短時離心去除固定液，PBS洗2遍，加 40μg/ml的 RNA 酶 400μl，于 37℃ 水浴 30 min，加入100μl PI染液混勻，4℃避光染色30min即可上機進行檢測，計算出不同倍體細胞的百分比。

1.5.5 小鼠睪丸組織形態(tài)學及超微結構觀察取單側睪丸石臘切片，HE染色，光鏡觀察睪丸組織內精原細胞與各級生精細胞的分布情況。環(huán)氧樹脂包埋，做超微切片，電鏡觀察睪丸組織內曲細精管及各級生精細胞超微結構的變化。

1.5.6 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)經SPSS 13.0軟件處理，實驗各個指標均用均數(shù)±標準差表示(±s)，各組均數(shù)之間比較進行one-way ANOVA檢驗。

2 結果

2.1 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸、附睪重量的影響

表1顯示，模型組小鼠睪丸重量和附睪重量顯著低于空白對照組，五子衍宗湯低、高劑量均可增加小鼠的睪丸及附睪重，但無顯著性差異。

表1 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸、附睪重量的影響(±s，n=8)

表1 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸、附睪重量的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較:*P<0.05，#P<0.01

組別 劑量(g/kg) 睪丸重(g) 附睪重(g)空 白 組 0.100±0.005*0.032±0.001*模 型 組 0.076±0.013 0.027±0.003五子衍宗湯低劑量組 2 0.087±0.010 0.028±0.002五子衍宗湯高劑量組4 0.089±0.014 0.029±0.002

2.2 五子衍宗湯對模型小鼠精子密度及精子活率的影響

表2顯示，模型組小鼠精子密度、精子活率顯著低于空白對照組。五子衍宗湯低、高劑量均可顯著增加生精障礙小鼠的精子密度。五子衍宗湯低、高劑量對生精障礙小鼠的精子活率也有一定的提升作用。

表2 五子衍宗湯對模型小鼠精子密度及精子活率的影響(±s，n=8)

表2 五子衍宗湯對模型小鼠精子密度及精子活率的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較:*P<0.05， P<0.01

組別 劑量(g/kg) 精子密度(106/ml) 精子活率(%)空 白 組91.25±13.08 67.00± 7.78模 型 組 28.31±5.64 37.13±11.51五子衍宗湯低劑量組 2 61.68±12.23 45.14±13.13*五子衍宗湯高劑量組 4 62.12±25.94 49.00± 7.62*

2.3 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸生精細胞周期的影響

表3顯示，模型組小鼠1C和4C細胞百分比顯著下降，2C細胞百分比相對升高。五子衍宗湯低、高劑量均可顯著增性恢復生精障礙小鼠各級生精細胞的百分比。

表3 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸生精細胞周期的影響(±s，n=8)

表3 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸生精細胞周期的影響(±s，n=8)

注:與模型組比較:*P<0.05， P<0.01

組別 1C(%) 2C(%) 4C(%)空 白 組52.45±3.17 15.78±1.53 25.46±1.79模 型 組 29.82±1.72 25.08±1.51 16.62±2.07五子衍宗湯低劑量組 40.46±4.73 17.16±1.90 21.91±1.45*五子衍宗湯高劑量組 46.00±0.66 17.60±2.25 18.35±2.45

2.4 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸組織形態(tài)學的影響

光鏡可見，模型組小鼠睪丸內生精小管多退化、萎縮，管壁生精上皮變薄，生精細胞層數(shù)減少，排列紊亂，精子細胞較少，腔內精子少見，睪丸生精小管間隙明顯增大。五子衍宗湯組小鼠睪丸內大部分生精小管的各級生精上皮細胞層次較明顯，排列較規(guī)則，管腔內可見較多成熟精子生成，基本達到正常的睪丸組織形態(tài)(結果見圖1)。

圖1 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸組織形態(tài)學的影響(HE×200)

2.5 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸組織超微結構的影響

電鏡下可見，模型組小鼠睪丸生精細胞較少，并可見明顯的生精細胞凋亡;治療組睪丸超微結構明顯恢復，五子衍宗湯組可見生精上皮變厚，見正常形態(tài)的精原細胞、精母細胞且生精上皮的中部有爆發(fā)產出的大量精子(結果見圖2)。

圖2 五子衍宗湯對模型小鼠睪丸組織超微結構的影響

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種臨床常見的抗腫瘤藥物，其機制主要是通過對DNA的烷化作用而干擾細胞內多種生物學功能。近代研究表明，環(huán)磷酰胺具有明顯的生殖毒性，對睪丸有明顯的損傷作用，導致無精子癥或少精子癥，造成不育［2］。通過臨床研究發(fā)現(xiàn)，在兒童期因白血病、實體腫瘤、自身免疫性疾病接受環(huán)烷化劑環(huán)磷酰胺治療的男性患兒，成年后80.2%～92.6%為無精子癥或少精子癥，可導致不育或者出現(xiàn)子代遺傳性缺陷或畸形［3］。中醫(yī)藥對生精障礙有較好的治療效果，但對環(huán)磷酰胺所致生精障礙的治療仍缺乏深入的研究。五子衍宗湯為臨床治療男性不育的常用方劑，本實驗探討了五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺致小鼠睪丸功能損害及生精障礙的保護作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)磷酰胺致生精障礙小鼠模型中，小鼠睪丸重量、附睪重量、精子密度、精子活率等顯著下降，生精小管退化萎縮，生精上皮層次減少，細胞排列紊亂，初級精母細胞(4C細胞)與精子細胞和精子(1C細胞)比例顯著減少。五子衍宗湯能夠拮抗環(huán)磷酰胺的生殖毒性，提高睪丸和附睪重量;顯著增加生精障礙小鼠的精子密度及精子的活率;修復睪丸生精小管生精上皮損傷，使生精小管結構基本恢復正常;促進精原細胞向初級精母細胞轉化，恢復各級生精細胞的比例。

睪丸是精子的生成場所，附睪則對精子的成熟起重要作用。研究結果提示，五子衍宗湯通過修復生精上皮，改善生精小管微環(huán)境，促進精子的形成和受損睪丸的修復，從而拮抗環(huán)磷酰胺導致的生精障礙，恢復其生殖功能。本實驗初步探討了五子衍宗湯對環(huán)磷酰胺致小鼠生精障礙的保護作用，為五子衍宗湯在臨床上進一步應用奠定了基礎。

［1］陳德宇，劉麗敏，謝慶東，等.抗精液抗體對精子線粒體功能的影響［J］.汕頭大學醫(yī)學院學報，2008，21(1):4-6.

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R285.5

B

1006-3250(2010)07-0570-02

國家自然科學基金資助項目(30973928)

2009-12-28

張長城(1973-)，男(土家族)，湖北長陽人，副教授，醫(yī)學博士，碩士研究生導師，從事中藥藥理學和中醫(yī)藥防治男科疾病機制研究。

△通訊作者:王洪武。Tel:0717-6397198，E-mail:hongwuang@126.com。