銀杏葉提取物對糖尿病大鼠體內氧化應激的影響

任 明,任淑萍,楊淑娟,凌 翎,孫景春

(1.吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室,吉林長春 130021;2.吉林大學中日聯誼醫院檢驗科,吉林長春 130021)

銀杏葉提取物對糖尿病大鼠體內氧化應激的影響

任 明1,任淑萍1,楊淑娟1,凌 翎1,孫景春2*

(1.吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室,吉林長春 130021;2.吉林大學中日聯誼醫院檢驗科,吉林長春 130021)

目的觀察銀杏葉提取物對糖尿病(D M)大鼠體內氧化應激水平的影響。方法利用Wistar大鼠建立糖尿病模型,將糖尿病大鼠分為糖尿病組(DM)和銀杏葉治療組(GBE),另設正常組動物為對照。D M組和正常對照組大鼠每日通過腹腔注射給予生理鹽水0.83 ml?kg-1,GBE組大鼠每日通過腹腔注射給予GBE 0.83 ml?kg-1,連續注射30天后取血測定各組大鼠血清中丙二醛(MDA)含量和超氧陰離子(O2-)水平,然后取出胰腺、腎臟測定MDA含量并采用免疫組化S-P法(鏈霉素抗生物素蛋白一過氧化物酶)檢測腎臟蛋白激酶C(PKC)的表達。結果與正常對照組相比,DM組和GBE組大鼠血清、腎臟和胰腺中MDA的含量及血清中超氧陰離子(O2-)的水平顯著升高(P＜0.05);GBE組大鼠血清、腎臟和胰腺中MDA的含量及超氧陰離子(O2-)的水平顯著低于DM組(P＜0.05)。免疫組織化學染色結果表明,D M組PKC表達顯著強于GBE組。結論銀杏葉提取物可減輕糖尿病大鼠體內的氧化應激水平,具有抗氧化作用,對糖尿病并發癥的發生發展具有一定的預防作用。

銀杏葉提取物;糖尿病;氧化應激

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0199)

糖尿病是多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂,是由于體內胰島素絕對或相對不足或靶組織對胰島素不敏感而引起的糖、脂肪、蛋白質代謝紊亂的疾病[1,2]。大量的研究發現氧化應激在糖尿病和糖尿病并發癥的發生、發展過程中起到非常重要的作用。銀杏葉提取物(GBE)是一種中藥提取物,研究證實GBE具有抗氧化清除自由基活性[3],本文給予糖尿病大鼠GBE,觀察銀杏葉提取物對糖尿病大鼠體內氧化應激的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 銀杏葉提取物注射液(德國威瑪舒培博士藥廠授權,臺灣濟生化學制藥廠股份有限公司生產,銀杏葉提取物含量為3.5 mg?ml-1);STZ購自北京鼎國公司;MDA、超氧陰離子含量測定試劑盒(南京建成);PKC抗體(福州邁新公司);SP試劑盒(福州邁新公司)

1.1.2 實驗動物 實驗動物選用WISTAR雌性大鼠(清潔級),體重(200±20)g,由吉林大學實驗動物中心提供。合格證號:(吉)2003-0007。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病模型建立 實驗用大鼠購回后飼養1周,觀察期大鼠的一般狀態,一般狀態良好的用于實驗。大鼠禁食12 h后,腹腔注射STZ,注射劑量為50 mg?kg-1,正常組大鼠腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液,注射劑量為50 mg?kg-1。注射STZ后,分別于注射第3、5、7日測定大鼠血糖,3次血糖測定值均高于16.7 mmo?L-1的大鼠為糖尿病模型大鼠。

1.2.2 實驗動物分組及治療措施 糖尿病模型大鼠分為糖尿病組(DM)和銀杏葉提取物治療組(GBE),另設一組正常大鼠為正常對照組(C),每組10只。DM組和正常對照組大鼠每日通過腹腔注射給予0.83 ml?kg-1的生理鹽水,GBE組大鼠每日通過腹腔注射給予0.83 ml?kg-1的GBE。連續給藥30天。

1.2.3 檢測血清中MDA和超氧陰離子的含量 按照試劑盒說明書的操作步驟進行操作并計算結果。

計算公式:MDA含量(nmol/ml)=(測定管的吸光度-空白管的吸光度)÷(標準管吸光度-標準空白管吸光度)×標準品濃度(10 nmol/ml)×樣本測試前稀釋倍數。超氧陰離子活力單位(U/L)=(測定管的吸光度-對照管的吸光度)÷(對照管的吸光度-標準管的吸光度)×標準濃度(0.15 mg/ml)×1 000 ml×樣品測試前的稀釋倍數。

1.2.4 檢測組織中MDA的含量 按照試劑盒說明書的操作步驟進行操作并計算結果。

計算公式:MDA含量(nmol/mgprot)=(測定管的吸光度-空白管的吸光度)÷(標準管吸光度-標準空白管吸光度)×標準品濃度(10 nmol/ml)÷蛋白含量(mgprot/ml)。

1.2.5 組織中蛋白激酶C(PKC)的表達 PKC抗體檢測采用免疫組化S-P法,按試劑盒說明書進行。結果評定:PKC表達陽性的細胞內出現棕色或棕黃色顆粒。根據光鏡下觀察陽性染色細胞的比例(5個高倍視野下的均數)分為:①陰性,染色細胞數＜10%;②陽性,染色細胞數在10%-50%;③強陽性,染色細胞數＞50%。

1.2.6 統計學處理 利用SPSS13.0統計軟件進行統計分析,各組間測定指標比較用方差分析。

2 結果

2.1 GBE對糖尿病大鼠氧化應激指標的影響

連續給藥30天后,與正常對照組相比,DM組和GBE組大鼠血清、腎臟和胰腺中MDA的含量及血清中超氧陰離子(O2-)的水平顯著升高(P＜0.05);GBE組大鼠血清、腎臟和胰腺中MDA的含量及超氧陰離子(O2-)的水平顯著低于DM組(P＜0.05),各組間具體的比較見表1、2。

2.2 腎臟組織中PKC表達的變化

經過30天的治療后,GBE組PKC的表達率為32%,DM組PKC的表達率為58%。各組間PKC表達強度比較見圖1。

表1 各組大鼠血清、胰腺、腎MDA含量的比較(±s)

表1 各組大鼠血清、胰腺、腎MDA含量的比較(±s)

注:*與正常組相比較,P＜0.05;#與DM組相比較,P＜0.05

Groups n 血清(nmol?L-1)胰腺(nmol?mg-1) 腎(nmol?mg-1)Control 10 8.86±2.47 0.44±0.21 6.96±0.55 DM 10 16.85±1.64* 0.89±0.32* 9.72±0.37*GBE 10 10.23±2.42*# 0.70±0.27*# 8.53±0.45*#

表2 各組大鼠血清O2-活性的比較(±s)

表2 各組大鼠血清O2-活性的比較(±s)

注:*與正常組相比較,P＜0.05;#與DM組相比較,P＜0.05

Groups n O2-(U/ml)Control 10 64.59±15.43 DM 10 110.36±20.19*GBE 10 88.67±18.66*#

圖1 各組大鼠腎組織中的表達PKC

3 討論

糖尿病是當前威脅人類健康的嚴重慢性疾病之一。長期的高血糖引起全身多系統的代謝障礙,導致大血管和微血管的病變,出現嚴重的心、腦、腎、眼、神經等的并發癥,嚴重影響糖尿病患者的生活質量,甚至危及生命[4]。在糖尿病的發生、發展過程中,氧化應激發揮了重要作用。本研究結果表明,糖尿病大鼠體內出現氧化應激,糖尿病大鼠體內的MDA、超氧陰離子水平顯著升高,PKC表達增強。PKC是導致體內出現氧化應激的重要因素。PKC激活后可改變血管通透性,刺激血管增生,促進粘附因子表達以及導致ROS的過多生成[5]。銀杏葉提取物通過其抗氧化活性,降低了糖尿病大鼠體內的MDA和超氧陰離子水平,減弱了PKC的表達,緩解了糖尿病大鼠體內的氧化應激狀況,預防了糖尿病的進一步惡化,對預防并發癥的發生起到一定的作用。本研究的結果提示,銀杏葉提取物可以作為糖尿病治療的輔助治療手段。

[1]AC Maritim,RA Sanders,JB Watkins.Diabetes,Oxidative Stress,and Antioxidants:A Review[J].J Biochem Molecular Tocicology,2003,17(1):24.

[2]P Newsholme,EP Haber,SM Hirabara,et al.Diabetes associated cell stress and dysfunction:role of mitochondrial and non-mitochondrial ROS production and activity[J].J Physiol,2007,583(1):29.

[3]黃 璞,劉力強,韓 勇,等.銀杏葉提取物對中樞神經系統藥理作用的研究進展[J].中國醫院藥學雜志,2005,25(6):553.

[4]Reynolds K,He J.Epidemiology of the metabolic syndrome[J].Am J Med Sci,2005,330(6):273.

[5]M Meier,J Menne,H Haller.Targeting the protein kinase C family in the diabetic kidney:lessons from analysis of mutant mice[J].Diabetologia,2009,52(5):765.

Effects of Ginkgo Biloba Extract on the Oxidative Stress in Diabetic Rats

REN Ming,REN Shu-ping,YANGShu-juan,et al.(Department of Hygienic Toxicology,School of Public Health,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo explore the effects of Ginkgo Biloba extract on the oxidative stress in diabetic rats.MethodsWistar rats were used to establish diabetic model rats,and the diabetic model rats were randomly classified into diabetic group in which the rats were administered saline intraperitoneally at the dose of 0.83 ml?kg-1,and GBE group in which rats were administered GBE intraperitoneally at the dose of 0.83 ml?kg-1.Normal ratswere used as normal control.After 30 days,the serum in rats from different groupswere collected to test the level of superoxide anion and malondialdehyde,the expression of protein kinase C(PKC)in kidney was alsto determined.ResultsThe level of MDA and superoxide anion in rats from diabetic group was significantly higher than those from normal control and GBEgroup.The expression ofPKC indiabetic ratswas stronger thanthat inGBE rats.ConclusionGBE can attenuate the oxidative stress in diabetic rats and play a role in the prevention of diabetic complicaiton development.

Ginkgo Biloba extract;diabetes mellitus;oxidative stress

R587.1

A

1007-4287(2010)02-0199-03

吉林省中醫藥管理局課題(08sys-063);吉林省衛生廳課題(20089010)

*通訊作者

2009-04-17)