乳酸測(cè)定在診斷線粒體病中的應(yīng)用研究

鄭宗富,劉奇才,劉永平,徐國(guó)焱,陳少華

(1.南京軍區(qū)福州總院476醫(yī)院,福建福州 350002;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

乳酸測(cè)定在診斷線粒體病中的應(yīng)用研究

鄭宗富1,劉奇才2,劉永平1,徐國(guó)焱2,陳少華1

(1.南京軍區(qū)福州總院476醫(yī)院,福建福州 350002;2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

目的探討血液中的乳酸水平能否成為線粒體基因突變患者的篩查指標(biāo)。方法選擇2型糖尿病(2-DM)530例,橫紋肌病33例,耳聾162例,健康對(duì)照120例,檢測(cè)受試者血液中的乳酸水平,并行線粒體基因組DNA分析,采用PCR-RELP技術(shù)進(jìn)行常見的線粒體突變位點(diǎn)篩查(mtDNAtRNAleu(uur)A1555G和mtDNAtRNAleu(uur)A7444G)和測(cè)序。結(jié)果線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突變組(2-DM、耳聾和橫紋肌病)的乳酸水平與mtDNA正常組及對(duì)照組比較均存在顯著差異(P＜0.05)。在162例耳聾患者中篩查出3個(gè)線粒體性耳聾家系(51人);530例糖尿病患者中篩查出一個(gè)G7444A突變的糖尿病家系(27人);33例肌病患者中篩查出1例線粒體肌病患者,而在對(duì)照組中未見mtDNA異常。結(jié)論乳酸檢測(cè)雖是線粒體病的非特異性指標(biāo),但能用于線粒體基因突變的早期篩查。

乳酸;線粒基因;突變

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0071)

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)線粒體病的診斷缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),現(xiàn)行的診斷主要依據(jù)臨床資料、肌肉活檢、線粒體酶復(fù)合體分析、線粒體呼吸測(cè)定、電鏡病理和組織化學(xué)檢查等[1],但上述方法并不適用于線粒體病早期篩查和早期診斷。近年,尋求線粒體病早期診斷的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)已成為各國(guó)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。本研究選取與線粒體基因突變關(guān)系密切的相關(guān)疾病即糖尿病(DM)、耳聾和肌病患者為研究對(duì)象,分析其臨床特征及其血液中的乳酸水平,并通過PCR-RELP技術(shù)驗(yàn)證其存在線粒體基因突變的方法來說明血液乳酸檢測(cè)在篩查線粒體病中的作用。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象

選取2005年6月至2007年12月間來我院及福建醫(yī)大附屬第一醫(yī)院就診的2型糖尿病(2-DM)患者530例、橫紋肌病33例、耳聾162例,作為疾病組;并選擇健康體檢者120名作為對(duì)照組,其空腹及餐后2 h血糖均正常,排除DM、耳聾、肌病家族史。

1.2 儀器試劑和方法

1.2.1 生化指標(biāo)測(cè)定 空腹血糖用Hitachi7060或OlmypusAU2700全自動(dòng)生化分析測(cè)定儀檢測(cè),血乳酸用美國(guó)強(qiáng)生V250干化學(xué)分析儀檢測(cè)。

1.2.2 線粒體DNA(mitochondria DNA,mtDNA)分析抽靜脈血1.8 ml,EDTA抗凝,蛋白酶K快速裂解法提取外周血總基因組DNA。

(1)mtDNA7444A→G突變檢測(cè),擴(kuò)增體系:模板2 μ l,引物[2]由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合 成 ,2.5 μ mol/L,上 游 :5′-CATATTCATCGGCGTAAATC-3′0.6 μ l;下游 :5′-GGTTCTCAGGGTTTGTT ATA-3′0.6 μ l,dNTP 10 mM 0.5 μ l,10 ×PCR 緩沖液2.5 μ l,Mg2+(25 mmol/L)2.0 μ l,Taq 酶 5 U/μ l(Promega公司)0.2 μ l,ddH2O 16.6 μ l。PCR 條件 :95℃5 min預(yù)變性,35個(gè)循環(huán)(94℃60 s變性,58℃60 s退火,72℃60 s延伸),72℃7 min終末延伸;取擴(kuò)增產(chǎn)物12 μ l,用限制性核酸內(nèi)切酶 XbaⅠ10 U(Promega公司),上樣緩沖液:2 μ l以2%瓊脂凝膠110V、25 mA電泳30 min,用溴化乙錠(EB)染色后紫外燈下觀察。

(2)mtDNA1555A→G突變檢測(cè):mtDNA1555位點(diǎn)引物為 nt1278-1298:5′-CCCTGATGAAGGCTACAAA GT-3′和 nt2018-1999:5′-CAGCTATCACCAGGCTCGG T-3′由上海生工公司合成。PCR反應(yīng)體積為25 μ l,含50 ng 樣品 DNA、25 μ mol/L引物(上下游)各0.4 μ l、0.2 mmol/L dNTP 0.5 μ l、10 ×PCR 緩沖液 2.5 μ l、2 mmol/L Mg2+、1 U Taq酶(Promega公司)。在PE9700熱循環(huán)儀上94℃5 min預(yù)變性后,94℃60 s→58℃60s→72℃60 s,35個(gè)循環(huán),72℃延長(zhǎng)10min。限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ酶切1小時(shí)后1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

mtDNA突變組的性別比例和年齡組成與非突變組比較無顯著差異。mtDNA突變組的乳酸水平(其中2-DM 16例、耳聾51例和橫紋肌病1例)與mtDNA正常組及對(duì)照組比較均存在顯著差異(P＜0.05),而mtDNA正常組與對(duì)照組比較不存在顯著差異(見表1)。在2-DM、橫紋肌病、耳聾者中共68例有mtDNA突變,健康對(duì)照組未檢出mtDNA突變。

表1 疾病組中有或無mtDNA突變者與正常對(duì)照組血液乳酸檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器,是細(xì)胞的供能場(chǎng)所,其通過氧化磷酸化合成ATP供給細(xì)胞各種生命活動(dòng)的需要。mtDNA具有獨(dú)特的遺傳學(xué)特性,包括母系遺傳、易突變、異質(zhì)性與閾值效應(yīng)等特點(diǎn),1989年Lemkes等首次報(bào)道了一個(gè)母系遺傳伴神經(jīng)性耳聾的DM家系。1992年Reardon和 van den Ouweland等又分別對(duì)有此特點(diǎn)的家系成員進(jìn)行了基因分析,發(fā)現(xiàn)mtDNA編碼的基因3243位點(diǎn)處鳥嘌呤(G)取代了腺嘌呤(A),認(rèn)為該突變是DM的致病基因,與線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(mitochondrialencephalomyopat hywith lactic acidosisand stroke-like episodes,MELAS)患者的突變位點(diǎn)相同[2,3]。線粒體DNA的A3243G基因突變降低了mtDNA編碼蛋白的穩(wěn)定性及相應(yīng)氨基酸與其tRNA的結(jié)合力,從而影響線粒體蛋白質(zhì)的合成。該點(diǎn)基因突變可致與轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)合障礙,相鄰tRNA生成減少,影響諸線粒體OXPHOS基因翻譯,影響骨骼肌OXPHOS功能,糖無氧酵解增加,乳酸生成增多[4]。

1994年,Reid等報(bào)道了一個(gè)蘇格蘭大家系,家族中有13名成員有不同程度的感音神經(jīng)性耳聾,基因分析發(fā)現(xiàn)這13名家族成員均有異質(zhì)性A7445G點(diǎn)突變,不同的研究均表明mtDNA3243A→G突變是線粒體DM中的常見類型,其發(fā)病率約1%。由于特殊的生物學(xué)環(huán)境和遺傳特點(diǎn)使mtDNA容易發(fā)生突變,并產(chǎn)生DNA異質(zhì)性,這也是造成該病家族成員具有顯著的表型異質(zhì)性的主要原因。由于所選擇的研究對(duì)象和條件不同,從不同人種群體研究的情況分析,除存在疾病分布不均的因素外,影響其診斷準(zhǔn)確性的最主要因素是mtDNA異質(zhì)性[5-8]。

劇烈運(yùn)動(dòng)后、循環(huán)衰竭和呼吸衰竭時(shí),由于組織缺氧,糖酵解增加,乳酸水平會(huì)升高;重癥肝病、尿毒癥、細(xì)菌感染、動(dòng)脈硬化性心臟病、重癥貧血時(shí),乳酸水平會(huì)升高。以上這些因素均可引起血清中乳酸升高,在篩查線粒體病時(shí)應(yīng)排除這些干擾因素。mtDNA突變組的乳酸水平(2-DM、耳聾和肌無力)顯著高于mtDNA正常組及對(duì)照組,且在乳酸增高的2-DM、耳聾和肌無力患者中篩查出3個(gè)線粒體性耳聾家系(51人)、1個(gè)G7444A突變的DM家系(27人)和1例線粒體肌病患者,而在對(duì)照組中未篩查出線粒體基因突變的患者。

通過乳酸篩查本文結(jié)合PCR-RELP技術(shù)驗(yàn)證乳酸增高患者中存在mtDNA異常,對(duì)乳酸異常患者的mtDNA分析及描述為研究線粒體DM、線粒體性耳聾等的防治提供了重要參考。

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Lactic acid in screen chondriogene disease

ZHENGZong-fu,LIU Qi-cai,LIU Yong-ping,et al.(No.476hospital of PLA Fujian,Fuzhou350002,China)

ObjectiveTo probe lactic acid in screen chondriogene mutation.MethodsThe lactic acid of patients was collected.And chondriogene mutationwas tested by PCR-RELP(mtDNAtRNAleu(uur)A1555G and mtDNAtRNAleu(uur)A7444G.ResultsThe lactic acid of chondriogene mutation group ishigher than normal control.A G7444A mutation family,three mtDNAtRNAleu(uur)A1555G family and one were found.ConclusionAnalysis of lactic acid can be use in screening chondriogene mutation.

Lactic acid;Chondriogene;Mutation

R596.2

A

1007-4287(2010)01-0071-03

2008-07-09)