電針治療對大鼠局灶性腦缺血酪氨酸羥化酶表達的影響

田明秀,陳加俊,趙 靜,黃艷蘋

(1.吉林大學第一臨床醫院神經內科,吉林長春 130021;2.天津市人民醫院;3.吉林大學中日聯誼醫院神經內科)

電針治療對大鼠局灶性腦缺血酪氨酸羥化酶表達的影響

田明秀1,2,陳加俊3*,趙 靜3,黃艷蘋3

(1.吉林大學第一臨床醫院神經內科,吉林長春 130021;2.天津市人民醫院;3.吉林大學中日聯誼醫院神經內科)

目的通過對電針治療后大鼠局灶性腦缺血模型(MCAO)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)表達改變的觀察,探討電針對腦可塑性的影響。方法將大鼠隨機分為對照組(正常大鼠)、實驗組(局灶性腦缺血的大鼠)、治療組(局灶性腦缺血的大鼠+針刺),采用熒光定量RT-PCR技術觀察各組大鼠TH的動態變化。結果治療組大鼠TH活性比實驗組有顯著提高呈陽性表達(P＜0.01),并已接近對照組的正常大鼠。結論大鼠局灶性腦缺血經針刺治療后可增強TH活性,改善局灶性腦缺血癥狀,可能是針刺治療腦缺血的機理之一,提示針刺可增強腦可塑性。

針刺;腦缺血;酪氨酸羥化酶(TH);RT-PCR

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0034)

在腦血管病中,以缺血性疾病的發病率居首位及其防治。缺血性腦損傷的機理以及如何預防和治療一直是該研究領域的重點。在缺血性腦損傷的研究過程中人們發現中樞神經系統神經元對缺血有不同的敏感性。如海馬區的錐體細胞對缺血最為敏感。缺血可導致神經元的變性、脫失、死亡。已研究證實由于缺血缺氧刺激神經元可出現神經營養因子表達的變化、海馬突觸網絡的重構[1]、腦內酶的變化[2]、第二信使的改變[3]、某些基因的改變[4]、微血管系統的改變、病灶周圍及病灶低級或高級部位的代償、離子通道的改變、潛伏通路和突觸的起用和軸突芽生等變化,這些變化導致病變系統內重組;而且在缺血缺氧后還會出現對大腦半球的代償,不同系統的潛伏通路和突觸的啟用,不同系統產生的行為代償,這些變化及病變系統間的重組共同影響了缺血后腦的可塑性。兒茶酚胺神經遞質參與多種生理代謝活動,包括睡眠、體溫調節、精神活動和情緒反應等。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是哺乳動物體內兒茶酚胺類神經遞質生物合成途徑的限速酶。大量的實驗表明,腦組織缺血時,腦內兒茶酚胺代謝發生紊亂以及酪氨酸羥化酶的表達發生變化。本實驗通過系統觀察電針治療前后大鼠局灶性腦缺血模型(MCAO)神經元酪氨酸羥化酶表達的改變,旨在研究腦梗死后腦可塑性的物質基礎,機制及與行為學的關系,并對電針對腦可塑性影響的機理進行探討。

1 材料與方法

1.1 模型制備與分組

實驗用純系Wistar大鼠,雌雄不拘,體重200-300 g,全部實驗用大鼠均由長春市高新技術開發區動物繁殖中心提供。采用大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法誘導出經典大鼠局灶性腦缺血模型。術后隨機分組,每24只為一組,分為實驗組(局灶性腦缺血的大鼠)、治療組(局灶性腦缺血的大鼠+針刺)。以上兩組與對照組(正常大鼠)各分成四個時間點,分別為 6 h、24 h、3 d、7 d。提取各組各時間段的大鼠腦組織。

1.2 電針方法

治療組動物清醒后立即給予針刺,其中,雙側內關穴及雙側足三里穴加電針,強度以大鼠肢體顫動為度,百會穴施以平補平瀉法,以醫生手下感到沉緊為度。

1.3 儀器及試劑

主要實驗儀器:超速低溫離心機:Germany Heraeus;紫外分光光度儀:上海第三分析儀器廠;PCR儀:America BIO-RAD company;水平電泳儀:北京六一儀器廠;紫外透射反射檢測分析儀:上海復生生物工程研究所;數碼照相機:SEAGULL DF-2。主要實驗試劑 :RNA提取試劑盒:(Promega產品);逆轉錄試劑盒:(MBI產品);Tag pluIDNA聚合酶:(Sangon產品);DNA-Marker;瓊脂糖;DEPC;飽和酚等以上試劑均購自寶生物工程有限公司。TH、β-actin引物序列:TH:正義鏈 5′ATGCCCAC-CCCCAGCGCCTC-3′;反義鏈 5′CTGACACTTTCCTTGGAACCA-3′;擴增片段長度 517 bp;內參照 β-actin;正義鏈鏈 5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′;反義鏈 5′-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3′;擴增片段長度305 bp;以上引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.4 實驗方法

1.4.1 提取總RNA 采用異硫氰酸胍法。取冰凍組織(0.1-0.2 g)剪碎后加入異硫氰酸胍變性液2 ml(100 mg/1 ml),冰上勻漿后 ,分裝 ,每管各 500 μ l。每管依次加入50 μ l 2 mmol/L的乙酸鈉;500 μ l水飽和酚;氯仿/異戊醇(24∶1)100 μ l,冰浴操作 ,充分混勻,4℃孵育15 min。12 000 rpm,4℃離心20 min,小心移上層水相至另一新的EP管中;加等量的異丙醇,-20℃沉淀1 h;4℃,10 000 rpm離心10 min。棄上清 ,懸 RNA 于 75%乙醇150 μ l中 ,振蕩,室溫孵育10 min;4℃,10 000 rpm離心 5 min;棄上清,總 RNA干燥至透明前。依據總RNA量多少加20-40 μ l不等的0.1%焦碳酸二已酯(DEPC)溶解RNA。用紫外分光光度儀測總RNA的產量,純度及濃度(波長260 nm/280 nm)。

1.4.2 cDNA的合成 據總RNA的濃度取適量的總RNA,使逆轉錄的總RNA 量為8 μ g,先65℃水浴10 min,RT反應液中依次加入5×Reaction buffer 4 μ l;20 U/μ l Ribonuclease inhibitor1μ l;2.5 mM dNTPs 2 μ l;100 μ g/mlOli(dT)18 1 μ l;100 U/μ l AMV 2 μ l;總 RNA2-4 μ l;加 0.1%DEPC 水至總體積 20 μ l。將上述混合液加入薄壁離心管中,置入PCR儀,反應條件為42℃,60 min,后95℃,10 min,得到 cDNA。

1.4.3 聚合酶鏈反應(PCR) PCR反應體系為:D.W26 μ l;10 ×PCRbuffer 5 μ l;25 mMMgCl 3 μ l;2.5 mMdNTPs 4 μ l;引 物正義鏈 1 μ l;引 物反義鏈 1 μ l;cDNA 10 μ l;引物濃度為 30 pmol/μ l a)目的基因的擴增:上述反應液先94℃,5 min,之后加入Taq plus-DNA聚合酶0.5 μ l/每管,用TH引物進行PCR,循環30個周期。b)內標準β-肌動蛋白(β-actin)的擴增:上述反應液先94℃,5 min,之后加入Taq plusDNA聚合酶0.5 μ l/每管 ,用 β-actin 的引物進行 PCR,循環30個周期。TH的PCR反應條件為:94℃,30 S,63℃,1 min,72℃,2 min。

1.4.4 PCR產物定量 10 μ l PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后,溴化乙錠(EB)染色,紫外燈下觀察結果,拍照。通過圖像分析將TH與β-actin輝度比值進行相對定量。統計學處理,方差齊性檢驗,兩均數比較用t檢驗。

2 結果

瓊脂糖凝膠電泳實時熒光定量PCR法檢測不同組TH的相對表達量見圖1、圖2。可見造模后缺血大鼠TH熒光定量在6 h、24 h、3 d、7 d均明顯缺失,與正常對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)。治療組經電針治療后尤其在7 d時TH熒光定量接近正常,與實驗組相比差異有顯著性(P＜0.01)。

3 討論

圖1 熒光定量PCR法檢測不同組TH的相對表達量

腦可塑性是中樞神經系統的重要特性,即在形態結構和功能活動上的可修飾性,可理解為中樞神經系統因適應機體內外環境變化而發生的結構與功能的變化。腦的可塑性是指在人的一生中,腦能夠改變其組織與功能的特性,它是腦組織的基本特征[5]。腦的可塑性[6]在結構上表現為:①受損神經細胞軸突的側枝芽生,增加在部分傳入靶區的投射密度。②新長出的側枝與靶細胞再建突觸聯系,可表現為部分傳入靶區內突觸性終末的數量先減少,后增加;或終末增大或每個終末上的突觸增多,或電活性增強等。③靶區內部分傳入的二級神經出現興奮性遞質受體上調,突觸后致密區擴大。④膠質細胞增多,增大等。近期的研究揭示腦缺血后的超早期(1-6小時)在腦梗死周邊區即可出現神經元高興奮性和其感受域的擴大等可塑性改變[7]。現已證實腦損傷后皮質功能發生重組,各層樹突數量呈時間依賴性增加,并且每一個神經元的突觸數量也明顯增加[6,8]。腦的發展是基因以及從環境中輸入的刺激等多個方面動態地相互作用的過程。在這個復雜的動態系統中 ,有機體逐漸適應偶然的輸入,滿足學習環境的需要,這一適應的過程即可塑性過程[9]。海馬也是大腦具有可塑性和極易受損的一個腦區,對缺血缺氧極為敏感。已有證據表明,海馬結構是參與學習和記憶力。

圖2 熒光定量PCR法檢測不同組TH的相對表達量

TH已知是哺乳動物體內兒茶酚胺(Catecholamine,CA)類(包括L-多巴胺,腎上腺素和去甲腎上腺素等)生物合成途徑的限速酶。在CA的合成中起催化限速的作用,現已有充分的證據證明TH是全部CA代謝的限速環節,并在第一步驟上調控整個代謝過程[10]。已知黑質多巴胺神經元及其分泌神經遞質,多巴胺在參與運動的調節方面起著重要作用。由此可知,TH在調節運動神經元的功能方面上發揮且重要的作用。TH在調節神經核團的運動性神經纖維傳入,傳出通路中有可能同樣發揮著重要作用。TH以酪氨酸為底物,相對含量較少,活性低,Km 值約為 50 μ mol?L-1,此酶專一性強(專一性作用于L-酪氨酸)活性較低,在神經元胞漿中的含量較少,因此成為兒茶酚胺類神經遞質合成過程中的限速因子。在兒茶酚胺類遞質生物合成的調節上,無論是突觸水平上的短周期調節,還是神經元胞體水平上的長周期調節都要通過對TH的作用來達到。因此對此酶活性的測定,有助于了解各種因子對兒茶酚胺合成的影響。老年人學習記憶功能減退、老年癡呆、帕金森氏病、衰老等都與兒茶酚胺類遞質有關。多巴胺(Dapamine,DA)能神經元是腦內分化最早,且表達遞質以及發出軸突到靶區的神經元之一。腦內多巴胺的作用是多方面的,它可能和軀體運動功能、垂體內分泌機能的加強以及精神活動的調節都有關系。在中樞神經系統,TH主要分布在多巴胺能神經元和去甲腎上腺素能神經元,因此,TH成為這些神經元的標記物。TH活性下降,DA生成減少,DA能神經元細胞變性,凋亡增加,并增加細胞對外源毒物的敏感性,更加重了腦組織的損害。

本實驗采用熒光定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術觀察各組大鼠TH的動態變化。PCR是分子生物技術實驗室中的首選方法之一,具有簡便、安全、快速、靈敏、特異性強等特點,近年來廣泛應用于動物的微生物檢測[10]。本實驗證實造模后大鼠TH因子缺血熒光定量明顯缺失,與正常對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)。治療組經電針治療后7d TH熒光定量接近正常,與實驗組相比差異有顯著性(P＜0.01)。說明電針治療可促進TH的表達,但其機制尚不十分清楚。可能與針刺糾正海馬神經細胞缺血、缺氧狀態、清除自由基、減少細胞的變性有關。TH表達陽性的可能預示突觸效率和新突觸生成等結構和功能具有可塑性改變。而針刺可增強突觸可塑性變化。

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Influence of electracupuncture on expression of tyrosine hydroxylase after focal cerebral ischemia in rats brain

TIAN Mingxiu,CHEN Jia-jun,ZHAO Jing,et al.(Dapartmet of Neurology,First Hospital,Jinlin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo probe the influence of electroacupuncte on expression of tyrosine hydroxylase after the focal cerebral ischemia in rat brain to find the effective mechanism of possibility.MethodsWistar rats were randomly divided into three groups:normal group;sham group and modelgroup(electroacupuncteure group).The technique of reverse transcription polymerase chain reaction is used to observe the dynamic changes of tyrosine hydroxylase.ResultsElectroacupunc ture could increase the tyrosine hydroxylase positive remarks in ischemia brain.ConclusionElectroacupuncture could protect brain against ischemic damage.Acupuncture treatrnent may be one of mechanisms of biain ischemia,suggesting that acupuncture can enhance brain plastcity.

Electroacupuncture;Cerebral ischemia;Tyrosine hydroxylase;RT-PCR

R741.02

A

1007-4287(2010)01-0034-04

*通訊作者,E-mail:Chenjiajun999@sina.com

田明秀(1971-),女,主治醫師,在讀醫學博士。主要從事腦血管以及神經變性疾病的研究。

2008-12-24)