膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染雪旺氏細胞的實驗研究

杜文彥,王景宏,劉欽毅,鄭長軍*

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科,黑龍江 佳木斯 154002;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130041)

膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)染雪旺氏細胞的實驗研究

杜文彥1,王景宏1,劉欽毅2,鄭長軍2*

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院 骨科,黑龍江 佳木斯 154002;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科,吉林 長春 130041)

目的應(yīng)用膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基因轉(zhuǎn)染雪旺氏細胞,觀察GDNF基因在雪旺氏細胞內(nèi)的表達效果,以及對雪旺氏細胞的營養(yǎng)作用。方法將雪旺氏細胞分為空白對照組、載體組、空載體組,通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo),將GDNF基因轉(zhuǎn)染雪旺氏細胞。用細胞增殖實驗(MTT)、免疫組化、流式細胞儀觀察在 24 h、48 h、72 h各組轉(zhuǎn)染后對細胞的營養(yǎng)作用。結(jié)果在載體組細胞的生長狀況較其他兩組增殖良好。免疫組化可見GDNF在載體組細胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達。流式細胞儀觀察基因轉(zhuǎn)染后對雪旺氏細胞有明顯的營養(yǎng)作用。結(jié)論GDNF基因轉(zhuǎn)染雪旺氏細胞后,在細胞內(nèi)呈現(xiàn)高表達,并對細胞有明顯的營養(yǎng)作用。

雪旺氏細胞;膠質(zhì)神經(jīng)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基因;轉(zhuǎn)染

Q785

A

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0020)

脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是一種嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病,神經(jīng)損傷后可導(dǎo)致神經(jīng)元死亡、局部瘢痕形成等一系列病理變化。神膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及雪旺氏細胞對神經(jīng)損傷后的修復(fù)起到重要作用,但是二者單獨應(yīng)用于神經(jīng)損傷的修復(fù)治療有其局限性,我們將膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)基因?qū)胙┩霞毎?觀察GDNF的表達和對細胞的營養(yǎng)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

雪旺氏細胞(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院生物工程實驗室提供)。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司);離心機(長沙湘儀公司);流式細胞儀(BD公司);高速冷凍離心機(Eppendorf公司);-80℃冰箱(三洋公司)。MTT(Sigma公司);DMEM(GIBCO公司);GDNF抗體(ADL公司);SP免疫組化試劑盒(福州邁新公司);LipofectamineTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Gibco公司)

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-N1/GDNF和質(zhì)粒pEGFP-N1分別通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入純化培養(yǎng)的雪旺細胞,同時設(shè)立空白對照組,以觀察SCs的GDNF的表達情況。其中空白對照組:不做轉(zhuǎn)染的SCs;空載體組:將質(zhì)粒pEGFP-N1轉(zhuǎn)染導(dǎo)入SCs;實驗組:將重組質(zhì)粒pEGFP-N1/GDNF轉(zhuǎn)染SCs。

1.2.2 質(zhì)粒的制備 將攜帶實驗組和空載體組的質(zhì)粒接種在含有選擇抗菌素的平皿上,培養(yǎng)成功后,在兩組分別取出100 U至20 ml的LB液體培養(yǎng)基中,在37℃過夜震蕩培養(yǎng)16-18小時。將培養(yǎng)好的菌液收集于離心管內(nèi),于4℃5 000 rpm離心15 min,棄上清。加0.1倍體積3 M醋酸鈉(pH4.6)混勻后冰浴靜止放置30 min以上。于4℃4 000 rpm離心15 min,棄上清。加無DNA酶的RNA酶(10 mg/ml)于上清液中,在37℃下培養(yǎng)30min。加等體積的酚:氯仿:異丙醇(25∶24∶1)混合液搖勻,于 4℃5 000 rpm離心10 min,加等體積95%乙醇,-20℃下放置30 min,于20℃5 000 rpm離心10 min,棄上清。加入等體積13%聚乙二醇溶液8 000(1.6 M/NaCl),在4℃下靜置過夜。離心10 min,4℃下10 000 rpm,棄上清。用70%冷乙醇洗滌并抽干,于-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雪旺細胞的培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存管中的SC,放入37℃恒溫水箱迅速復(fù)溫,并不斷搖動,使之迅速融化,待融化后,轉(zhuǎn)移至75 ml培養(yǎng)瓶內(nèi),800 r/min離心5 min,棄上清。加入含10%高糖DMEM培養(yǎng)基至5 ml,在37℃,含 5%CO2的飽和濕度的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,更換新鮮培養(yǎng)液。待貼壁細胞達80%-90%左右時采用胰酶消化法按1∶4傳代,觀察細胞生長狀態(tài)良好時,準備轉(zhuǎn)染。

1.2.4 細胞的轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的細胞,胰酶消化,調(diào)細胞濃度為2×105,分別接種于6孔培養(yǎng)板,每孔2 ml。置37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)使細胞貼壁,培養(yǎng)6-24小時。觀察細胞密度達80%時,進行下列操作。取一Ep管,空載體組與載體組分別取5 μ g質(zhì)粒,加無血清、無抗生素培養(yǎng)基至97 μ l,空白對照組直接加無血清、無抗生素培養(yǎng)基至 97 μ l,取 3 μ l脂質(zhì)體加入到上述混合液中。振蕩混勻或漩渦混勻2 s,室溫孵育15 min。用無血清、無抗生素培養(yǎng)基洗細胞2次,加無血清、無抗生素培養(yǎng)基,將上述混合液加至培養(yǎng)液表面,充分混勻,注意不能濺到培養(yǎng)板蓋上。8小時后,更換完全培養(yǎng)基。72小時后熒光顯微鏡檢測

1.3 觀察指標(biāo)

倒置顯微鏡下觀察細胞的轉(zhuǎn)染效果;用MTT方法檢測轉(zhuǎn)染后細胞的生長情況;用免疫組化觀察轉(zhuǎn)然后的雪旺氏細胞中的GDNF表達情況;用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細胞的細胞周期,觀察細胞增殖情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)采用Excel軟件包進行統(tǒng)計分析和處理,每兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細胞效果

轉(zhuǎn)染24 h后開始行倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達強度。轉(zhuǎn)染24 h后,可見空白對照組未見熒光細胞表達。空載體組和載體組雪旺細胞在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光。至培養(yǎng)72 h,高倍顯微鏡下可見空載體組和載體組綠色熒光亮度增強(圖1),表明細胞轉(zhuǎn)染效果較好。

圖1 倒置顯微鏡下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SCs細胞的熒光表達

2.2 MTT檢測結(jié)果

在用MTT方法檢測三組(空白對照組、空載體組、載體組)細胞24小時、48小時、72小時的生長狀況顯示:24小時時細胞生長狀況無明顯的變化,48小時空載體組細胞數(shù)減少,這說明單純的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對細胞有一定的毒性作用。在72小時載體組的細胞數(shù)量與空白對照組及空載體組比較有明顯差異(P＜0.01)。說明GDNF轉(zhuǎn)染雪旺氏細胞對細胞有明顯的營養(yǎng)作用,見表1。

2.3 免疫組化檢測結(jié)果

免疫組化染色72小時后鏡下觀察顯示:空白對照組和空載體組SCs胞漿內(nèi)有淺棕色免疫復(fù)合物沉積,而載體組的SCs中胞漿內(nèi)有深棕色免疫復(fù)合物沉積(圖2),表明GDNF基因在SCs中成功表達,且載體組GDNF的表達較空白對照組和空載體明顯增多。

2.4 流式細胞儀檢測結(jié)果

在用流式細胞儀方法檢測三組(空白對照組、空載體組、載體組)細胞24小時、48小時、72小時的 S期細胞增殖情況見表2。

表1 不同時間各組細胞增殖實驗檢測結(jié)果

圖2 鏡下質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SCs細胞的免疫組化圖

表2 不同時間各組流式細胞儀檢測結(jié)果

3 討論

膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)是由1993年Lin等[1]首先發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)因子,是從大鼠膠質(zhì)細胞系B49的無血清培養(yǎng)基中經(jīng)濃縮、分離純化出來的。初期研究發(fā)現(xiàn)GDNF對中腦的多巴胺能神經(jīng)元有較高的營養(yǎng)作用,隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)GDNF家族成員對運動神經(jīng)元具有營養(yǎng)作用。可以阻止體內(nèi)運動神經(jīng)元退變,對脊髓運動神經(jīng)元起保護作用[2]。通過實驗研究表明,GDNF是現(xiàn)階段神經(jīng)營養(yǎng)因子中作用最強的[3-5]。GDNF基因已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于神經(jīng)損傷后的修復(fù)的基礎(chǔ)實驗中。實驗證明了由于腦脊屏障的存在,單純的GDNF治療受到明顯限制。

雪旺氏細胞(Schwann cells,SCs)可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子,在周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)中具有重要作用。雖然雪旺氏細胞對神經(jīng)損傷的修復(fù)有較強的營養(yǎng)作用,但是單純雪旺氏細胞移植治療很難穿越星形膠質(zhì)細胞形成的瘢痕區(qū)域。這是由于單純SC移植神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌量不足、且分泌具有時效局限性及在損傷脊髓的膠質(zhì)瘢痕中存活不良所致,因此單純SC移植治療神經(jīng)損傷很難達到理想的效果。

在我們的實驗中,我們通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo),將膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)入雪旺氏細胞中,形成基因修飾的雪旺氏細胞,觀察基因在雪旺氏細胞中的表達效果以及神經(jīng)營養(yǎng)因子對雪旺氏細胞的營養(yǎng)作用。實驗結(jié)果表明,通過陽離子脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pEGFP-N1/GDNF轉(zhuǎn)入雪旺氏細胞中,能夠高效表達膠質(zhì)細胞神經(jīng)營養(yǎng)因子,表達的神經(jīng)營養(yǎng)因子對雪旺氏細胞具有明顯的營養(yǎng)作用,對進一步應(yīng)用基因修飾的雪旺氏細胞移植治療脊髓損傷打下堅實的基礎(chǔ)。相信隨著相關(guān)研究的深入,脊髓損傷治療的效果能夠得到進一步提高。

[1]Lin LF,Doherty DH,Lile JD,et al.GDNF:a glial cell line derived neurotrophic factor for midbrain dopaminerigic neurons[J].Science,1993,260(5111):1130.

[2]Milbrandt J,Desauvage FJ,Fahrner TJ,et al.Persephin,a Novel Neurotrophic Factor Related to GDNF and Neurtuin[J].Neuron,1998,20:245.

[3]Kasahara K,Nakagawa T,Kubota T.Neuronal loss and expression of neurotrophic factors in a model of rat chronic compressive spinal cord injury[J].Spine,2006,1531(18):2059.

[4]Lim PA,Tow AM.Recovery and regeneration after spinal cord injury:a review and summary of recent literature.Ann Acad Med Singapore[J].2007,36(1):49.

[5]Macias MY,Syring MB,Pizzi MA,et al.Pain with no gain:allodynia following neural stem cell transplantation in spinal cord injury[J].Exp Neurol,2006,201(2):335.

The Experimental Study of Glial Cell Line-derived Neurotrophic Factor Gene Transfection to Schwann Cells

DU Wen-yan,WANGJing-hong,LIU Qin-yi,et al.(The OrthopedicsDepartment of theFirst Hospitalof JiamusiUniversity,Jiamusi154002,China)

ObjectiveTo observe the expression of GDNF and the role of nutrition and protection in Schwann cells through GDNF gene's transfetion to Schwann cells.MethodsThe Schwann cells were divided into control group,empty vector group,vector group.The GDNF gene was transfected into Schwann cellsthrough cationic liposome mediattion.The nutritional function and expression effectwere examined thoughMTT,immunohistochemistry,flow cytometry at 24 h,48 h,72h after transfection of eachgroup.ResultsThe cells in vector group were more proliferated and vigorous than the other two groups in MTT;Immunohistochemistry showed high expression of GDNF in vector group;There were obvious nutritional role of transfectedGDNF gene on Schwann cells in flow cytometry.ConclusionAfter GDNF gene transfection to Schwann cells,there were high expression of GDNF gene which had obvious nourishing and protective effects on Schwann cells.

Schwann cells;Glial-derived neurotrophic factor;transfection

1007-4287(2010)01-0020-03

吉林省科技廳資助課題,課題編號為200705222

*通訊作者

2009-05-22)