羥基喜樹堿對人前列腺癌PC-3m細胞凋亡的影響

金光虎,陳 爽,楊 麗,王光蘭,孔祥波*

(1.吉林大學中日聯誼醫院泌尿外科,吉林長春 130033;2.吉林大學白求恩醫學院病理學教研室)

羥基喜樹堿對人前列腺癌PC-3m細胞凋亡的影響

金光虎1,陳 爽2,楊 麗2,王光蘭2,孔祥波1*

(1.吉林大學中日聯誼醫院泌尿外科,吉林長春 130033;2.吉林大學白求恩醫學院病理學教研室)

目的觀察羥基喜樹堿(HCPT)對前列腺癌PC-3m細胞凋亡的影響,初步探討其作用機制。方法采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細胞儀(FCM)及激光共聚焦顯微鏡(CLSM)檢測細胞增殖與凋亡變化。結果HCPT作用后PC-3m生長明顯受抑,且呈時間-濃度依賴性;在FCM及CLSM上可見凋亡率增加。結論HCPT體外能有效抑制前列腺癌細胞株生長;但其作用機制目前尚需進一步研究。

羥基喜樹堿;前列腺癌,凋亡;化療

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0012)

羥基喜樹堿(Hydroxycamptothecin,HCPT)是從我國特有且資源豐富的喜樹中提純的抗癌藥,具有廣泛的藥理學作用。近年來HCPT對于其他腫瘤細胞作用的研究報道日見增多,其體內外的抗腫瘤活性受到極大關注[1]。本實驗對HCPT誘導前列腺癌PC-3m細胞凋亡進行研究,以探討其能否誘導PC-3m細胞凋亡及抗腫瘤機制。

1 材料與方法

1.1 材料 前列腺癌細胞株PC-3m由吉林大學基礎醫學院病理教研室惠贈。HCPT注射液(黃石飛云制藥公司)。RPMI-1640培養基(GIBCO公司);小牛血清(天津灝洋公司);MTT及DMSO(北京博奧森公司);Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將PC-3m置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中,37℃、體積分數5%CO2飽和濕度培養箱培養,細胞呈單層貼壁生長后取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞抑制率檢測 采用MTT法。取生長良好的PC-3m細胞,調整細胞濃度至(1-2)×104個/ml接種于96孔培養板內,待細胞貼壁后實驗組分別加入終濃度為 1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1×100mg/ml的HCPT,空白對照組不加藥物。每組設3個復孔,放入CO2培養箱內培養12 、24、48 h,然后每孔加 MTT 溶液 20 μ l(5 mg/ml),再培養4 h,棄上清,每孔加入 100 μ l DMSO 振蕩 ,使結晶完全溶解,在全自動酶標儀上測定吸光度值(A值),計算不同濃度藥物作用后細胞生長抑制率,實驗重復3次,取平均值。細胞生長抑制率(%)=(對照組A值-加藥組A值)/對照組A值×100%。

1.2.3 細胞凋亡率檢測 以不含EDTA的胰酶消化收集經過不同濃度藥物處理的PC-3m細胞(1-2)×106,PBS 洗滌兩次(1 200 rpm 5 min),加入500 μ l的 binding Buffer懸浮細胞 ,加入5 μ l Annexin V-FITC混勻后再加入 5 μ l PI混勻,室溫避光反應 5-10 min,上FCM及CLSM檢測細胞凋亡率。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件,結果以±s表示。采用方差分析和 t檢驗。檢驗水準 α=0.05。

2 結果

2.1 細胞抑制率 HCPT 1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1×100mg/ml各組細胞增殖抑制率分別為 2.56%、5.45%、26.57%、56.07%、87.42%和88.27%。隨HCPT作用濃度的增加,細胞增殖逐漸減慢。HCPT對細胞增殖的抑制率隨藥物濃度的增高而增大,二者呈正相關關系(r=0.761,P＜0.05)。應用IC50計算公式算出給藥12 h、24 h、48 h 的 IC50分別為:5.421×10-2、2.371×10-3、7.981×10-4mg/ml,顯示 IC50隨藥物作用時間延長而降低。

2.2 細胞凋亡率及死亡率 圖1為流式細胞儀檢測結果。陰性對照組 、1×10-2、1×10-1、1×100mg/ml組凋亡率分別為 2.0%、11.8%、18.7%及17.5%。死亡率為4.1%、2.8%、2.3%及6.6%,經過不同濃度藥物處理后凋亡率及死亡率呈上升趨勢。重復實驗顯示類似結果。

2.3 CLSM檢測細胞凋亡率 在激光共聚焦顯微鏡下,早期凋亡細胞胞膜呈固縮狀的綠色熒光,晚期凋亡細胞胞膜呈固縮狀的桔紅色熒光,活細胞胞膜結構正常不著色。依據上述標準,鏡下計數并計算各組細胞凋亡率。結果表明,1×10-1mg/ml HCPT處理組和對照組處理24 h的PC-3M細胞,各組凋亡率分別為(43.78±0.85)%和(2.24±1.07)%,HCPT組凋亡率與對照組比較,差異均有顯著性(P＜0.01)。(見圖2)。

圖1 苦參堿對細胞凋亡率及死亡率的影響

圖2 Annexin V/FITC與PI雙染色檢測HCPT對PC-3m細胞誘導凋亡作用

3 討論

HCPT是一種天然抗癌藥物,具有廣譜抗腫瘤作用。而誘導腫瘤細胞凋亡是許多化療藥物發揮治療作用的主要機制[2],目前HCPT已知的抗癌途徑在于通過嵌合抑制DNA拓撲異構酶Ⅰ而成為細胞周期特異性的抗癌藥[3]。近年來有研究表明,喜樹堿類抗癌藥的細胞毒作用與其抑制的活性并不一致,提示喜樹堿類藥物尚有其他抗腫瘤機制[4]。

本研究中利用形態學和細胞生物學方法證實HCPT對PC-3m細胞具有細胞毒作用及可以誘導其凋亡。MTT試驗結果表明,HCPT對體外PC-3m細胞的抑制率與作用時間、藥物濃度呈正相關;其半數抑制濃度隨藥物作用時間延長而降低。CLSM觀察藥物處理后的細胞,形態學表現為染色各不相同、細胞結構相差各異。早期凋亡細胞胞膜呈固縮狀的綠色熒光,晚期凋亡細胞胞膜呈固縮狀的桔紅色熒光,活細胞胞膜結構正常不著色。通過FCM測細胞凋亡率見隨著藥物濃度增加細胞凋亡率明顯增加。

我們通過實驗證實HCPT對PC-3m細胞具有細胞毒作用及可以誘導其凋亡,但其療效尚需通過動物實驗及臨床實驗進一步證實。

[1]Pienta KJ,Coffey DS.A structural analysis of the role of the nuclearMatrix and DNA loops in the organization of the nucleus and chromosome[J].J Cell sci suppl,1999,1:123.

[2]Gilligan T,Kantoff PW.Chemotherapy for prostate cancer[J].Urology,2002,60(3):94.

[3]Cho YS,Cho-Chung YS.Antisense protein kinaseA RIalpha acts synergisticallywith hydroxycamptothecin to inhibit growth and induce apoptosis in human cancer cells:molecular basis for combinatorial therapy[J].Clin CancerRes,2003,9(3):1171.

[4]Feng LF,Zhong M,Lei XY,et al.Bcl-2 siRNA induced apoptosis and increased sensitivity to 5-fluorouracil and HCPT in HepG2 cells[J].J Drug-Target,2006,14(1):21.

Hydroxycamp to the cininduced human prostate cancer Line PC-3m cell apoptosis

JIN Guang-hu,CHEN Shuang,YANGLi,et al.(Department of Urology,China-Japan Union Hospital of Jilin University,Changchun130033,China)

ObjectiveTo study the feasibility of treatment of prostate cancer using HCPT and itsmechanism.MethodsAdd a certain concentration of HCPT in human prostate cancer PC-3m cell incubated together,using the method of MTT、FCM and CLSM to detect the changes in cell proliferation and apoptosis.ResultsHCPT can inhibit the growth of human prostate cancer PC-3m cell obviously,and showing a time-a concentration-dependent;The rate of apoptosis increases in FCM and CLSM.ConclusionHCPT can inhibit the growth of human prostate cancer PC-3m cell in vitro tests.However,the mechanism is yet to be further studied.

hydroxycamptothecin;prostate carcinoma;apoptosis;chemotherapy

R735.7

A

1007-4287(2010)01-0012-02

*通訊作者

2009-03-08)