抗癌活性肽-S誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及對細(xì)胞周期的調(diào)控

王朝陽,楊成旺,歐陽曉暉,蘇秀蘭

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010050)

抗癌活性肽-S誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及對細(xì)胞周期的調(diào)控

王朝陽,楊成旺,歐陽曉暉,蘇秀蘭*

(內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010050)

目的探討抗癌活性肽-S對荷肝癌小鼠腫瘤的抑制作用及其可能機(jī)制。方法建立荷肝癌小鼠皮下種植瘤模型,隨機(jī)分三組,分別給5-Fu,20 mg/Kg,抗癌活性肽-S 0.4 ml/只,對照組給同體積的生理鹽水,尾靜脈注射,隔日給藥連續(xù)10天。10天后處死小鼠,計(jì)算重量抑瘤率;取瘤組織制備石蠟切片,原位雜交法檢測瘤細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)情況并計(jì)算瘤組織微血管密度(MVD),免疫組化法檢測瘤組織中Ki67的表達(dá)情況;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡。結(jié)果抗癌活性肽-S具有較好地抑制肝癌細(xì)胞增殖生長及血管生成作用,抑制率為49.43%,且對VEGF m R NA及Ki67表達(dá)有較顯著的抑制作用(P＜0.01);流式細(xì)胞儀分析顯示,抗癌活性肽-S可以阻滯腫瘤細(xì)胞停止于S期,促進(jìn)瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)論抗癌活性肽-S具有抑制肝癌細(xì)胞生長增殖的作用,其抗肝癌細(xì)胞增殖作用機(jī)制為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,調(diào)控細(xì)胞周期。

抗癌活性肽-S;抑瘤作用;肝腫瘤;細(xì)胞凋亡

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0001)

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué),免疫生物學(xué)和腫瘤免疫學(xué)的飛速發(fā)展,生物治療逐漸被人們所重視,已被公認(rèn)為“腫瘤的第四大治療模式”[1],抗癌活性肽-S(anti-cancer bioactive peptide-S,ACBP-S)來源于動(dòng)物臟器,是經(jīng)過對羊誘導(dǎo)后產(chǎn)生的小分子物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)建立了小鼠荷人肝癌皮下種植模型,采用常規(guī)組織病理切片、HE染色、流式細(xì)胞術(shù)、、原位雜交、免疫組化等技術(shù),分析了抗癌活性肽-S對肝癌細(xì)胞增殖的影響及其對腫瘤細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控作用,以期探討抗癌活性肽-S對荷肝癌小鼠的抑瘤作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 抗癌活性肽-S由內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心分離提取,4℃保存。5-氟尿嘧啶(Fluorouracilum,5-Fu):規(guī)格,0.25 g/10 ml,南通制藥總廠生產(chǎn)。

1.1.2 細(xì)胞株 肝癌細(xì)胞H 22由北京大學(xué)腫瘤研究柯楊教授饋贈(zèng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明白鼠30只,內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心購買。鼠齡為4-5 wk,體重18-22 g,雌雄各半,分籠飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 荷肝癌H-22小白鼠皮下種植瘤模型的建立

復(fù)蘇肝癌細(xì)胞H-22,離心,收集細(xì)胞放入1 ml生理鹽水中混勻,等分兩份,二只昆白鼠腹腔注射,飼養(yǎng)一周后取小鼠腹水制備模型。無菌條件下取小鼠腹水約10 ml,按1∶2稀釋成細(xì)胞懸液,每份0.4 ml,細(xì)胞計(jì)數(shù)約在1.9×108細(xì)胞/ml,按0.4 ml/只接種于小鼠右腋皮下,建立肝癌模型。接種腫瘤細(xì)胞4 h后,將昆白鼠隨機(jī)分三組,雌雄各半,按組分為①5-Fu組,20 mg/Kg?d,②ACBP-S 組,0.4 ml/只?天;③生理鹽水對照組,0.4 ml/只?天,以小鼠尾靜脈注射方式給藥。接種瘤細(xì)胞12 h后開始給藥,隔日給藥一次,共給藥五次。

1.2.2 標(biāo)本采集及相關(guān)分析 (1)計(jì)算荷瘤小白鼠抑瘤率。抑瘤率=[(NS組平均瘤重-治療組平均瘤重)/NS組平均瘤重]×100%。(2)處死荷瘤鼠后30 min內(nèi)取瘤組織,10%中性甲醛固定后,常規(guī)石蠟包埋,切5 μ m切片,HE染色,光學(xué)顯微鏡下低倍、高倍觀察。(3)瘤細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)檢測:采用VEGF原位雜交試劑盒(博士德公司生產(chǎn))檢測瘤組織VEGF mRNA表達(dá)。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。胞漿棕黃色染色為陽性,高倍鏡下計(jì)數(shù),陽性細(xì)胞百分率作為mRNA表達(dá)水平。(4)瘤組織Ki-67抗原表達(dá)檢測:按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行操作。Ki-67染色信號(hào)定位于細(xì)胞核,胞核出現(xiàn)深棕色為陽性標(biāo)記。(5)流式細(xì)胞儀檢測瘤組織的細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。①細(xì)胞周期檢測:經(jīng)消化、離心、上機(jī),輕輕搖勻上樣管,B.D公司標(biāo)準(zhǔn)Beads校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀,cell quest獲取細(xì)胞10 000個(gè),觀察不同組別細(xì)胞周期變化。ModFit軟件分析。②Annexin-V-FITC試劑盒檢測凋亡:樣本制備同細(xì)胞周期的測定。制備100 μ l細(xì)胞懸液分別加入4個(gè)5 ml試管中。加熒光染料,輕輕混勻,PI避光,孵育15 min,各管中加400 μ l 1×Binding Buffer,1 h內(nèi)上機(jī)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì),根據(jù)實(shí)驗(yàn)資料的要求采用單因素方差分析法統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 抗癌活性肽-S組對H-22荷肝癌小白鼠皮下種植瘤的抑制作用

小鼠尾靜脈注射5-Fu、抗癌活性肽-S均可明顯抑制腫瘤生長,抑瘤率分別是5-Fu組61%,抗癌活性肽-S組49.43%(見表1)。

表1 ACBP-S對小鼠H22種植瘤的生長抑制作用

2.2 瘤組織切片光鏡觀察

生理鹽水組細(xì)胞呈異質(zhì)性,核分裂相多,可見較多的血管。抗癌活性肽-S組可見大量壞死細(xì)胞,以及灶狀淋巴細(xì)胞浸潤,也可見有炎細(xì)胞浸潤,并可見較多的核固縮、體積縮小的細(xì)胞。

2.3 原位雜交法檢測瘤細(xì)胞VEGF mRNA的表達(dá)及微血管數(shù)分析

實(shí)驗(yàn)中用PBS水代替原位雜交探針做陰性對照實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明瘤細(xì)胞中無陽性表達(dá),提示本實(shí)驗(yàn)檢測VEGF mRNA是特異性表達(dá)。圖像分析系統(tǒng)對各組瘤細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)進(jìn)行平均光密度數(shù)值統(tǒng)計(jì)。顯示其表達(dá)以NS組最高,依次是抗癌活性肽-S組、5Fu組(見表2及圖1)。分析結(jié)果表明NS組表達(dá)最強(qiáng),而給予抗癌活性肽-S治療后可以使肝癌細(xì)胞中VEGFmRNA的表達(dá)減弱。

圖1 各實(shí)驗(yàn)組VEGFmRNA表達(dá)

各組瘤組織微血管數(shù)(MVD)計(jì)算。MVD記數(shù)參照Maeda[2]方法,計(jì)算5個(gè)視野內(nèi)微血管數(shù),取其平均數(shù)作為MVD值。結(jié)果顯示NS組MVD值最高,5-Fu組及抗癌活性肽-S組明顯低于NS組,有顯著性差異,各組瘤組織MVD平均值見表2。

2.4 免疫組化法檢測瘤組織Ki67表達(dá)

計(jì)數(shù)采用Ki67指數(shù)[3],指每個(gè)標(biāo)本低倍鏡(×100)下觀察并確定有代表性的Ki67染色陽性視野,選擇5個(gè)視野,即高倍鏡(×400)下每個(gè)視野數(shù)200個(gè)腫瘤細(xì)胞,計(jì)算其陽性細(xì)胞總數(shù)。Ki67定位于細(xì)胞核,陽性細(xì)胞可見細(xì)胞核染色為棕褐色或棕黃色,與被蘇木素襯染成藍(lán)色的陰性胞核區(qū)別明顯。Ki67指數(shù)值以NS組、抗癌活性肽-S組、5-Fu組的順序下降。治療組與NS組比較Ki67值均有顯著型差異(見圖 2,表 2)。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組Ki67表達(dá)

表2 ACBP-S對 VEGF mRNA、MVD、Ki67表達(dá)的影響

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞周期及凋亡細(xì)胞數(shù)的變化

抗癌活性肽-S作用后S期比例為40.89%,較NS組14.18%明顯增加;凋亡率抗癌活性肽-S組為8.96%,較NS組2.37%明顯增加。5-Fu組S期比例38.36%也明顯高于NS組,凋亡率是6.95%(見圖3)。凋亡細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì),抗癌活性肽-S組明顯高于NS組,略高于5-Fu組(見圖3及表3、4)。

圖3 ACBP-S對細(xì)胞周期和凋亡率的影響

表3 各治療組細(xì)胞周期的比較

表4 各組凋亡率及凋亡細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

抗癌生物活性肽-S(已獲得國家發(fā)明專利,專利號(hào):ZL96122223610),它來源于經(jīng)過誘導(dǎo)的動(dòng)物臟器,是一種新型抗癌生物制劑。前期蘇秀蘭等[4-6]以大量體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,ACBP-S能夠抑制胃癌、白血病、卵巢癌、膽囊癌等多種腫瘤細(xì)胞的DNA合成,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化,降低腫瘤病人機(jī)體血液黏稠度,改善微循環(huán),調(diào)節(jié)患癌機(jī)體無氧糖酵解代謝,提高機(jī)體免疫力。ACBP-S對BGC-823細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用,并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其抑癌機(jī)制可能與其調(diào)控細(xì)胞周期有關(guān),使p27mRNA重獲表達(dá),從而發(fā)揮抗BGC-823細(xì)胞增殖的作用。王玉芳等[7]通過ACBP-S作用于荷胃癌裸鼠后,發(fā)現(xiàn)ACBP-S組胃癌移植瘤中PCNA陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組,提示ACBP-S能降低胃癌移植瘤細(xì)胞的增殖活性,使之生長速度減慢。而ACBP-S組的腫瘤中caspase-8的表達(dá)均升高,提示ACBP-S可能通過促進(jìn)或誘導(dǎo)caspase-8的活化而激活整個(gè)凋亡通路。

肝癌是惡性程度最高的腫瘤之一,高復(fù)發(fā)且預(yù)后差。國內(nèi)外研究表明肝細(xì)胞癌的預(yù)后與某些分子指標(biāo)有關(guān),其中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是近年研究的熱點(diǎn)之一[8-12]。在本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中,通過原位雜交法檢測VEGF的表達(dá),統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組瘤細(xì)胞中VEGF表達(dá)的平均光密度的值,結(jié)果顯示VEGF的表達(dá)強(qiáng)弱不同,生理鹽水組最強(qiáng),各給藥組按肝肽、脾肽、5-Fu的順序減弱。說明5-Fu及活性肽可以抑制腫瘤細(xì)胞中VEGF的生成,血管生成的環(huán)節(jié)受到抑制,抑制腫瘤組織血管的生成,阻斷腫瘤生長所需營養(yǎng),致使腫瘤細(xì)胞緩慢生長,最終抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)5-Fu存在明顯的毒副作用。5-Fu是現(xiàn)今公認(rèn)的有效的抗腫瘤藥物,它可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長,其毒副作用導(dǎo)致荷瘤小鼠免疫功能下降,攝入量減少,后期出現(xiàn)體重下降,毛色差等反應(yīng)。而兩個(gè)活性肽給藥組的小鼠一般狀態(tài)較5-Fu組好,攝入飲食量無改變,小鼠體重始終在增加,毛色也較好,提示活性肽具有改善荷瘤機(jī)體生活質(zhì)量的作用。

MVD被認(rèn)為是能反映腫瘤血管生成的一個(gè)指標(biāo)[13],近年來研究證實(shí),許多惡性腫瘤組織中的MVD計(jì)數(shù)都顯著增高,MVD計(jì)數(shù)高者易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),且往往和惡性腫瘤差的預(yù)后相關(guān),是一個(gè)僅次于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)后評(píng)估因子。它與腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)和供氧有關(guān),是一個(gè)反映淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立預(yù)后評(píng)估因子[14]。本試驗(yàn)通過原位雜交法檢測腫瘤組織中微血管表達(dá),在腫瘤組織中微血管呈棕色表達(dá),計(jì)算微血管數(shù),結(jié)果顯示治療組明顯少于生理鹽水組的微血管數(shù),與腫瘤生長呈正相關(guān),說明活性肽可以抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生VEGF,減少了腫瘤組織中微血管生成,通過血管供給組織的營養(yǎng)減少,抑制腫瘤組織的生長,最終達(dá)到抑制腫瘤組織的目的。

Ki-67抗原為細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白,在細(xì)胞周期 S、G1、G2、M 期均有表達(dá),G0 期缺如。由于其半衰期短,有絲分裂后迅速降解,故常作為檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性可靠的標(biāo)記[15]。Ki-67反應(yīng)細(xì)胞的增殖活性,其標(biāo)記指數(shù)與有絲分裂指數(shù)顯著相關(guān),在肝癌中最高陽性表達(dá)率可達(dá)95%[16]。本實(shí)驗(yàn)通過圖像分析系統(tǒng)對各組瘤組織中Ki67表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì),結(jié)果顯示生理鹽水組瘤組織Ki67指數(shù)值最高,治療組按肝肽組、脾肽組、5-Fu組的順序下降。說明生理鹽水組未給予任何抗癌藥物,瘤組織增殖旺盛,增殖細(xì)胞較多。抗癌活性肽及5-Fu的作用使瘤組織增殖受到抑制,組織中增殖細(xì)胞減少,出現(xiàn)一些凋亡及壞死細(xì)胞。兩組活性肽抑制瘤組織增殖的作用較5-Fu組略弱,但Ki67指數(shù)與生理鹽水組比較有顯著性差異,提示活性肽抗癌機(jī)制之一是通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及壞死,達(dá)到抗腫瘤的治療效果。

Ki67的表達(dá)主要受細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)的影響,而營養(yǎng)供應(yīng)又與組織的位置和血管生成情況密切相關(guān),淺表部位的MVD常常較高,越靠近瘤體中心的部位的MVD值越低,表現(xiàn)出異質(zhì)性。實(shí)驗(yàn)中觀察病理切片也看到位于腫瘤邊緣的微血管較多,這可能與建立模型后血管是從周圍組織中長入瘤組織有關(guān)。而且檢測Ki67的表達(dá)與VEGF mRNA的表達(dá)強(qiáng)弱的趨勢是相同的,這也說明瘤組織中血管增生旺盛,通過血管為腫瘤組織提供較多的營養(yǎng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖旺盛,促進(jìn)腫瘤組織的發(fā)展。當(dāng)血管生成因子受到抗癌藥物的抑制后,腫瘤細(xì)胞營養(yǎng)供應(yīng)差,瘤細(xì)胞的增殖受到抑制,最終起到抑制腫瘤的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為,腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡失衡有密切關(guān)系[17-18]。腫瘤的發(fā)生不僅是與細(xì)胞增殖速度有關(guān)。還與細(xì)胞凋亡速度有關(guān)。細(xì)胞增殖是細(xì)胞生命活動(dòng)的基本表現(xiàn)之一,是一種受到嚴(yán)格調(diào)控的精確有序過程,腫瘤細(xì)胞則表現(xiàn)為調(diào)控失常,不受節(jié)制地?zé)o限繁殖通過影響或調(diào)節(jié)細(xì)胞周期可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞分化或?qū)е录?xì)胞死亡。現(xiàn)有的一些抗腫瘤藥物就是通過影響細(xì)胞周期而發(fā)揮作用的[19-22]。另外,在腫瘤治療過程中,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死(對瘤細(xì)胞的直接細(xì)胞毒作用)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、分化也是藥物治療腫瘤的基本出發(fā)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示活性肽組瘤細(xì)胞的核分裂相明顯較生理鹽水組減少,腫瘤組織的壞死灶數(shù)目增多。并且,抗癌活性肽在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、分化兩方面同時(shí)發(fā)揮了抑瘤作用,這一點(diǎn)參照流式細(xì)胞儀分析結(jié)果得以證實(shí)。流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期的測定可以看出,活性肽組S期細(xì)胞比例較生理鹽水組明顯增高,G0/G1、G2/M期細(xì)胞比例明顯下降,與生理鹽水組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且活性肽組的細(xì)胞凋亡率也明顯高于生理鹽水組,凋亡細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)明顯較生理鹽水組高。提示活性肽有阻滯腫瘤細(xì)胞停止于S期作用,G0/G1期細(xì)胞不斷進(jìn)入S期,腫瘤細(xì)胞阻滯于S期后S期細(xì)胞增加,而G0/G1期、G2/M 期細(xì)胞減少,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。這個(gè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)中免疫組化Ki67的結(jié)果相同,活性肽使G2/M期的瘤細(xì)胞減少,分裂增殖的細(xì)胞減少,Ki67指數(shù)下降,表明活性肽可以阻滯瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期,誘導(dǎo)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、分化,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,最終起到抗腫瘤的作用。而與對照5-Fu組比較,盡管5-Fu組顯示較好的抑瘤作用,S期細(xì)胞數(shù)增加,G0/G1、G2/M期細(xì)胞減少,也有阻滯腫瘤細(xì)胞在S期的作用。但是,小鼠的生活質(zhì)量顯著下降,包括食欲差、消瘦、活動(dòng)減少。

綜上所述,抗癌活性肽-S是一種較為有效的提高荷肝癌白鼠免疫功能的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,可以通過提高機(jī)體免疫功能,激發(fā)體內(nèi)的免疫活性細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖,實(shí)現(xiàn)整體的抗腫瘤效果。隨著分子腫瘤學(xué)和細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,抗腫瘤生物活性肽的研究與開發(fā)將逐漸引起人們的重視[23],同時(shí)將在腫瘤的綜合治療中顯示其較好的應(yīng)用前景。

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Anti-cancer bioactive peptide-S induced apoptosis of hepatoma cells and cell cycle regulation

WANG Chao-yang,YANG Cheng-wang,OUYANG Xiao-hui,et al.(Clinical Research Center of Affiliated Hospital,Inner Mongolia Medical College,Hohhot010050,China)

ObjectiveTo study the inhibitory effect of anti-cancer bioactive peptide-S(ACBP-S)on the tumor of liver cancer loadedmouse and the possible mechanisim.MethodsEstablished liver cancer loaded mouse mode and divided mice into three groups randomly and gave drugs through tail intravenous injection,the drugs were 5-Fu(20 mg/kg)and ACBP-S 0.4ml per mouse.NS was given to the control group at the same dosed and in the same way.Every other day for 10 days.Then,executed mice after 10 days and calculated weight inhibitory rate.Tumor tissueswere embedded with paraffinwax and made into slices.Detected the expression of VEGFmRNA and calculatedMVD of tumor tissues and the expression of Ki67 proteinwith immune histochemistry,also detecded cell cycle distribution and cell apoptosis rate.ResultsThe ACBP-S could inhibit tumor growth and angiogenesis.The inhibitory rate were individually 49.43%.The expression of VEGF mR NA and ki67 were decreased in ACBP-S groups(P＜0.01).ACBP-S could arrest tumor cells atS phase andinduce tumor cellsinto apoptosis.ConclusionACBP-S may obviously inhibit the proliferation of liver cancer cells and induce tumor cells into apoptosis.

ACBP-S;tumor inhibitory effect;liver tumor;cell apoptosis

R735.7

A

1007-4287(2010)01-0001-06

國家自然科學(xué)基金(30860327)

*通訊作者,E-mail:xlsu@hotmail.com

2009-08-14)