食藥用菌菌種的液體深層培養

余兆豐

(江蘇鎮江余兆豐生物技術開發研究所,鎮江 212001)

1 液體深層發酵的技術要點

21世紀是生物工程的世紀,筆者五十多年來一直與微生物打交道,先后從事病源性微生物——病毒、衣原體、立克次氏體、支原體、細菌、放線菌、真菌等的研究,期間申報了10項系列專利,前5項為制種專利,后5項為大生產應用專利。

食藥用菌液體菌種必須無菌抽樣作純菌及生長力兩項試驗,現談幾點食藥用菌深層培養制種及生產應用技術要領,以供參考。

1.1 純菌試驗

作固、液態兩種,弱酸性 (pH 6.5～7.0)、弱堿性 (pH 7.2～7.4)兩種試管培養基,抽樣接種后放至24～26℃及35～37℃培養箱內培養。細菌一般在35～37℃條件下培養1～3天判結果,真菌一般在24～26℃條件下培養3～7天判結果。將污染的雜菌 (細菌及霉菌)檢查出來,如無雜菌,只生長目的菌,為合格。

1.2 生長力試驗

滅菌后的玻片,在空平皿或空試管中滴一滴菌液,放至適宜溫度下1～2天后鏡檢,生長力強的數小時便肉眼可見白色菌絲生長,在顯微鏡下可見到透明度好、著色性強、顆粒不多的菌絲體,能看到鎖狀聯合的是最佳狀態。

使用液體菌種需要達到絕對的純菌和強生長力。另可測pH、菌球數、重量、碳氮比等作為參考。

1.3 深層培養的制種設備與技術關鍵

近幾年,筆者設計了夾層控溫或玻璃不銹鋼發酵罐與滅菌冷卻相結合的方法,通過技術 (專利)+設備 (專利)的應用,控制污染效果理想。

加溫及保溫均在夾層內進行 (電熱管置于夾層),滅菌時夾層加溫是傳導熱,100℃以上產生蒸汽后以軟管或硬管引至內層,對所有管道進行對流蒸汽滅菌,特別是下出液的下口,不留死角。

滅菌后除采用常規循環水傳導冷卻外,還將無菌空氣由進氣口導入進行正壓對流冷卻,不產生負壓,以免導致滅菌后污染。

任何微生物生產均要把好消毒滅菌關、無菌操作關、培養技術關,嚴防雜菌 (細菌、霉素及本菌外的其他真菌)污染。

筆者80年代設計的變壓脈沖滅菌技術,達到了起磅升溫時間短,滅菌徹底,不存死角的效果;可以不扎繩、不蓋蓋,易滅菌,易冷卻,易接種。滅菌后冷卻除常規傳導冷卻外,還通過將過濾空氣壓入滅菌鍋內,產生對流冷卻,進出端均有過濾裝置,停電時空氣不會反流污染。此氣再壓入另一個密閉的空間內,進出又裝有過濾器,先吹出的是滅菌后的濕空氣,降塵埃;再吹出的是滅菌后的熱空氣,干燥;最后吹出來的是室溫的過濾空氣。讓此密閉空間的氣壓永遠大于外界的氣壓,形成超凈環境,培養基出鍋后可直接開放式接種,速度快,效果好,無污染,解決了目前滅菌冷卻難題,適用于流水線大生產。

食藥用真菌深層培養采取管道式密閉接種,無菌操作要達到百分之百成功,須在第一級發酵瓶內放1/3玻璃球或玻璃塊,配很薄一層半固體 (液固體也可)培養基滅菌后按一般無菌操作規程接入菌種。裝入液體培養的管道,一端要接在液體培養基瓶中,一次操作接入所有管道,不再開瓶口。在無污染、目的菌生長良好的情況下,由管道反壓液體培養基至菌種瓶中培養,其他按常規操作,便可達100%成功。

深層培養的空氣過濾要求濾菌越徹底越好,氣損失越少越好,兩者不能兼得時,則可損失一些氣。筆者采用小氣量滅菌棉花球過濾。棉花有阻擋、截流、靜電吸附、過濾等四種作用,但不能潮濕,任何過濾器及介質均不能潮濕。

2 液體菌種深層培養技術的大生產應用

采用筆者的專利 “蒸汽滅菌系統及其滅菌冷卻方法”,在冷卻時通入經過過濾的凈化氣流,出氣端設置過濾裝置,避免停電時空氣回流污染;滅菌高壓鍋旁的密閉空間也設置過濾裝置,使空間氣壓永遠大于外界氣壓,使之成為級別相當高的GMP車間。在此環境下,可采用大料滅菌,搞自動化、流水線,先接種后裝瓶 (袋),然后裝框床栽。實施中,若采用真空冷卻,料溫從100℃降到30℃只需10分鐘,其速度之快是現有普通冷卻方法難以比擬的。這項發明,徹底解決了現有大生產中滅菌、冷卻工藝中的不合理部分。

在大生產中,通過掌握最佳生長時間,適時放罐,之后應用固態發酵配合,解決污染問題。其中特別要掌握好以下5點:①營養好一點。因為最佳狀態出現在生長期的對數期階段,微生物就像孩子處在青春發育期一樣,需要供給足夠的營養,尤其是碳、氮源要有保證。②固體培養基水分少一點。因為液體菌種本身就是液態,生長快,水分太多就會影響呼吸。③氧氣多一點。注意通風,供給足夠的氧氣。④酸堿度適中。不要像固體培養基那樣有意將pH調高以控制污染。因為固體菌種接下去的是一個塊,接觸不合適的pH死后變酸的是一個面,其他面還可生長;而液體菌種就會不吃料,不生長。⑤在允許溫度范圍內,溫度要偏高一點,否則將由目的菌產生能量抵抗外界溫度才能供其生物能之用。掌握好了上述5點,雜菌長不過目的菌,菌絲體產品只需2～3天就能完成。

3 十項專利項目題錄

(1)一種食用菌液體培養方法(ZL:86102421.4);

(2)袋栽食用菌液體菌種多管接種器 (ZL:87209482.0);

(3)液體菌種深層培養簡易裝置(ZL:87210089.8);

(4)無菌空氣輸出控制器 (ZL:88206277.8);

(5)微生物制品生產用簡易發酵裝置 (ZL:98227774.1);

(6)雙態微生物液體掊養菌絲體的兩次發酵法(200510007461.2);

(7)螺旋式發酵罐 (ZL:200520004916.0);

(8)食用菌培養基滾筒式滅菌器(ZL:200520004915.6);

(9)一種液體菌種直接生產木腐菌類的方法(ZL:200510007460.8);

(10)蒸汽滅菌系統及其滅菌冷卻方法 (ZL:200810024591.0)。