李寶聚博士診病手記（二十）如何利用顯微鏡簡易診斷蔬菜細(xì)菌病害

張珊珊 李寶聚 王相晶 謝學(xué)文 石延霞

在生產(chǎn)實踐中，基層農(nóng)民和相關(guān)從業(yè)人員，對蔬菜細(xì)菌病害的田間識別主要是通過發(fā)病癥狀進(jìn)行診斷，但植物病害的發(fā)生是致病菌、寄主和環(huán)境共同作用的產(chǎn)物，土壤、溫濕度、輪作物等環(huán)境條件的差別可能導(dǎo)致病原物積累、發(fā)病癥狀甚至致病菌自身發(fā)生變化，這樣，一種病害表現(xiàn)的癥狀就不一而足。單是憑借癥狀識別細(xì)菌病害不準(zhǔn)確，容易誤診。在很多時候，人們的傳統(tǒng)認(rèn)識還拘泥在病斑水浸狀、流膿、腐爛等就是細(xì)菌病害的固定模式中，實際上，這種認(rèn)識是不科學(xué)的。我們在廣泛采集標(biāo)本鏡檢、鑒定的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，很多生理性病害也會有細(xì)菌病害的常見癥狀，比較可靠的方法是利用顯微鏡對病部進(jìn)行顯微診斷，根據(jù)有無病原細(xì)菌菌體溢出（簡稱菌溢，切開感病組織后，組織液中大量繁殖的細(xì)菌溢出）來判別細(xì)菌病害，這是比較科學(xué)的方法，也很簡單易行。

在蔬菜生產(chǎn)中，茄果類青枯病、瓜類細(xì)菌性果腐病、十字花科軟腐病及馬鈴薯環(huán)腐病都是常見的為害性很強(qiáng)的細(xì)菌病害，也是世界性的重要病害，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。僅2009年8、9月發(fā)生在貴州省修文縣的番茄潰瘍病造成的番茄絕產(chǎn)就達(dá)66.7 hm2。所以，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對細(xì)菌病害的正確識別尤為重要，早期發(fā)現(xiàn)、對癥下藥，可減少一定的經(jīng)濟(jì)損失。

細(xì)菌病害主要侵染植株的葉片、果實和根莖部等器官。我們以小白菜黑腐病〔由油菜黃單胞菌油菜致病變種Xanthomonas campestris pv.campestris（Pammel）Dowson.引起〕病葉和番茄青枯病〔由青枯假單胞桿菌Pseudomonas solanacearum（Smith）Smith引起〕病莖為例，來具體介紹如何對病葉和病莖切片顯微觀察菌溢。

1 葉部細(xì)菌病害顯微觀察

1.1 切片的制作 采集新鮮的植物感病葉片（彩色圖版1）。取一塊干凈的載玻片，在中間滴1滴清水（最好是飲用純凈水），不宜過多，1滴即可。在病健交界處（發(fā)病組織和健康組織的交界處），用干凈（紗布擦拭即可，沒有紗布，面巾紙擦拭也可以）的刀片（我們用的是實驗室專用切片刀片，用男士雙面刮胡刀片也可，注意防止劃傷手指）切取大約5 mm見方的組織（彩色圖版2）。在載玻片的干燥處，用刀片將切下的組織按“十”字形劃成4小塊（彩色圖版3），以破壞被侵染組織，使其中的細(xì)菌大量釋放（經(jīng)我們的研究證明，真正由細(xì)菌引起的病害感病組織中定會有大量的細(xì)菌存在，破壞組織可使其快速溢出）?？捎玫都庹荷倭克掣叫〉那衅M織蘸入水滴中（彩色圖版4）。先將蓋玻片的一側(cè)觸到水滴（彩色圖版5），輕輕蓋上蓋玻片，注意避免氣泡的產(chǎn)生。使清水在蓋玻片下充分展開（彩色圖版6）。用吸水紙吸干多余的水。

1.2 顯微鏡觀察 把做好的切片放在低倍顯微鏡下觀察（物鏡10倍即可），將切片上的感病組織置于光源投射的中心，調(diào)節(jié)粗準(zhǔn)焦螺旋直到切片與目鏡的距離最近，緩慢調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，使載物臺緩慢下降，視野中若有物質(zhì)一晃而過時即停止調(diào)節(jié)，調(diào)回原來的位置，移動到病組織邊緣，可見溢出的大量云霧狀細(xì)菌菌體（彩色圖版7）。燈光不宜過亮，視野調(diào)暗更易觀察。若想觀察更清楚，可轉(zhuǎn)換到高倍鏡下觀察，適當(dāng)調(diào)亮視野。

感病組織菌溢非常明顯時，可把做好的切片對準(zhǔn)燈光，或放在黑色背景下，肉眼即可見白色向外擴(kuò)展的細(xì)菌菌溢（彩色圖版8）。

2 根莖部細(xì)菌病害顯微觀察（以莖部病害為例）

2.1 切片的制作 采集一段新鮮的植物感病莖部。取一塊干凈的載玻片，在中間滴1滴清水。找到莖表皮的感病處（內(nèi)部一般有病灶），用無菌的雙面刀片（莖組織內(nèi)部包含韌皮部和木質(zhì)部，排列比較緊密，需用鋒利的刀片，注意防止劃傷手指）縱剖，可見感病變色的木質(zhì)部或韌皮部，縱向切取薄薄的一小片感病的內(nèi)部組織（彩色圖版9）。在載玻片的干燥處，用刀片把切片中健康的部分（主要是白色沒有病變的組織）除去，將感病組織切成幾塊?？捎玫都庹荷倭克畬⑿〉那衅M織蘸入水滴中。先將蓋玻片的一側(cè)觸到水滴，輕輕蓋上蓋玻片，注意避免氣泡的產(chǎn)生。因為莖部組織較厚實，1滴水可能無法完全浸潤感病組織，可從蓋玻片邊緣酌量滴入少許水，使感病組織在蓋玻片下充分展開浸潤。用吸水紙吸干多余的水。

2.2 顯微鏡觀察 觀察方法同葉部細(xì)菌病害。

3 生理病害與細(xì)菌病害顯微診斷區(qū)別

在生產(chǎn)中，有些生理性病害也有水漬狀、流膿、腐爛等癥狀，如常見的黃瓜泡狀斑點?。ú噬珗D版10）、辣椒臍腐病等，都很容易與細(xì)菌病害發(fā)生混淆。為了便于大家更好的識別細(xì)菌病害，我們以黃瓜泡狀斑點病為例，將鏡檢制片結(jié)果與被病原細(xì)菌侵染的感病組織進(jìn)行對比，便于大家進(jìn)一步了解如何正確的診斷和區(qū)別細(xì)菌病害與生理病害。

發(fā)生黃瓜泡狀斑點病的病葉正面有黃白色小泡狀凸起，葉背面病斑周圍水浸狀（彩色圖版11），所以生產(chǎn)中很容易被誤認(rèn)為細(xì)菌病害。通過病組織切片顯微觀察，確認(rèn)其沒有菌溢（彩色圖版12），與細(xì)菌病害病組織切片對比觀察，區(qū)別更為明顯。這也充分說明對蔬菜細(xì)菌病害的簡易診斷，顯微觀察是真正科學(xué)和有效的方法。