院內制劑夏膝顆粒中迷迭香酸含量的HPLC測定

陳 珍，成光宇，位鴻，何蕊，陳 穎*

（1長春中醫(yī)藥大學，長春 130117；2長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021）

夏膝顆粒處方為首屆國家名中醫(yī)黃永生教授的臨床經(jīng)驗方，用于治療眩暈之痰瘀互結證型的高血壓，于臨床上取得良好的療效，將其開發(fā)成院內制劑—夏膝顆粒，本制劑由夏枯草、牛膝、茺蔚子、決明子等八味藥組成，夏枯草為本方中的君藥，現(xiàn)代藥理學實驗證明夏枯草具有良好的降壓作用[1]，其中迷迭香酸是夏枯草中的有效成分[2-3]。本試驗以夏枯草中迷迭香酸對照品作為對照，研究并建立了HPLC迷迭香酸的含量測定方法，可以作為夏膝顆粒質量控制的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津LC-2030C）；紫外檢測器（LC solution色譜數(shù)據(jù)工作站）；色譜柱（島津Inertsil，規(guī)格：4.6 mm×250 mm，5 μm）；超聲波清洗機（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）； CP225D型電子天平（德國sartorius公司）。1.1.2藥品與試劑 迷迭香酸對照品（批號：111871-202007，規(guī)格：每支20 mg，采購于中國食品藥品檢定研究院）；甲醇為色譜純，水為超純水；其它試劑均為分析純。供試樣品：夏膝顆粒（批號：20220101、20220102、20220103）。

1.2 色譜條件與系統(tǒng)適應性

十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相：甲醇-0.1%三氟乙酸（40:60）；檢測波長330 nm；流速1.0 mL·min-1。進樣量5 μL；迷迭香酸的理論塔板數(shù)不低于6 000[4]；柱溫為25 ℃。

1.3 對照品溶液的制備

精密稱取對照品迷迭香酸10.06 mg，置10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，得濃度為1.006 mg·mL-1的溶液；再精密吸取上述溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得濃度為0.1006 mg·mL-1的對照品溶液[4]。

1.4 供試品溶液的制備

取本品粉末（過四號篩）約4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，超聲處理（功率240 W，頻率50 kHz） 30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[4]。

2 方法學驗證

2.1 專屬性考察

精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各5 mL，注入液相色譜儀，色譜圖見圖1、2、3。

圖1 迷迭香酸對照品高效液相色譜圖

圖2 供試品溶液高效液相色譜圖

圖3 陰性對照溶液高效液相色譜圖

可見在此條件下，迷迭香酸峰與其它峰分離較好，陰性對照無干擾。

2.2 線性關系考察

分別精密吸取迷迭香酸對照品溶液1 mL，2 mL，5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，注入液相色譜儀，測定，以進樣量（mg）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。

回歸方程：Y = 2 799 488.530 8 X-3 981.079 0，r = 1.000 0 ，迷迭香酸線性范圍為0.050 3 mg～1.006 0 mg。結果見圖4。

圖4 迷迭香酸標準曲線

2.3 耐用性考察

2.3.1 流速的考察 選擇0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1、1.2 mL·min-1的流速進行試驗，含量測定結果：RSD為0.51%，說明流速對測定結果影響不大。結果見表1。

表1 流速考察結果

2.3.2 柱溫考察選擇25℃，30℃，35℃，依法測定，考察柱溫對分離效果的影響，測定結果：迷迭香酸的RSD為5.58%（見表2）。其中25℃，30℃條件下迷迭香酸RSD為1.60%，但25℃條件下供試品的峰是融合峰，基線未完全分離；30℃，35℃條件下迷迭香酸RSD為7.40%，說明柱溫對含量測定結果影響較大，柱溫要控制在30℃。

表2 不同柱溫考察結果（25℃，30℃，35℃）

2.3.3 不同色譜柱的考察選取不同品牌的色譜柱考察其對試驗結果的影響，RSD為0.19%，說明不同色譜柱對其測定結果影響不大。結果見表3。

表3 不同色譜柱考察結果

綜上所述，通過對流速、柱溫、不同流動相比例和不同品牌色譜柱的考察試驗，發(fā)現(xiàn)流速和不同品牌色譜柱的變動測定結果影響較小，柱溫和不同流動相比例對測定結果影響較大，在試驗中需要控制。

2.4 穩(wěn)定性考察

精密吸取對照品溶液和同一供試品溶液各5 mL，分別在0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，24 h依法測定，以迷迭香酸峰面積積分值為指標。結果見表4。

表4 穩(wěn)定性考察結果

結果：對照品溶液的RSD為0.50%，供試品溶液的RSD為0.52%，24 h內穩(wěn)定性良好。

2.5 精密度考察

精密吸取對照品溶液和同一供試品溶液各5 mL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次。結果見表5。

表5 精密度考察結果

精密度考察結果顯示：對照品溶液的RSD為0.21%，供試品溶液的RSD為0.10%，方法、儀器的精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性考察

精密稱取同一批樣品6份，照1.4供試品溶液項下制備方法制備，依法獨立測定。結果見表6。

表6 重現(xiàn)性考察結果

考察結果：RSD為1.92%，平均含量為0.330 7 mg·g-1，此方法的重現(xiàn)性良好。

2.7 準確度試驗

供試品的制備：取重復性試驗同批樣品2 g，研細，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加0.704 2 mg·mL-1的迷迭香酸溶液1 mL，加入稀乙醇49 mL，超聲處理30 min，放冷，稱定其重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。共制成6份樣品，依法測定，計算回收率。結果見表7。

表7 回收率試驗結果

測定結果：RSD為1.47%，平均回收率為97.72%，本法準確性較好，方法可行。

2.8 含量測定

取三批中試樣品，依法制備供試品溶液，依法測定。結果見表8。

表8 三批中試含量測定結果 mg·g-1

故暫定：本品每袋顆粒含夏枯草以迷迭香酸（C23H28O11）計，不得少于2.40 mg。

本品三批中試樣品含量測定的平均結果為0.341 0 mg·g-1，本品規(guī)格為每袋裝10 g，含量限度按測定結果平均值的80%計算：制劑中迷迭香酸含量×每袋裝量×80% = 0.341 0 mg·g-1×10 g/袋×80% = 2.727 9 mg/袋。但投料時，每批夏枯草藥材的含量有高有低，也可以按中國藥典規(guī)定的夏枯草藥材的含量和提取轉移率計算，根據(jù)正交試驗的驗證性試驗結果，迷迭香酸的平均轉移率70.53%（按驗證的轉移率計算），按《中國藥典》夏枯草項下“含迷迭香酸（C23H28O11）不得少于0.30%”的規(guī)定[4]，標準處方中，夏枯草220.0 g，制成1 000 g，本品規(guī)格為每袋裝10 g，含量限度按測定結果平均值的80%計算，本品每袋顆粒含夏枯草以迷迭香酸的計，計算公式：夏枯草藥材量×夏枯草藥典含量×平均轉移率×每袋裝量×80%÷標準處方量= 220 g×0.20%×70.53%×10 g/袋×80%÷1 000 g = 2.48 mg/袋

3 結論

藥典以甲醇-0.1%三氟乙酸（42:58）為流動相，在此條件下，供試品色譜中迷迭香酸色譜峰與相鄰f峰分離欠佳，將流動相比例調整為甲醇-0.1%三氟乙酸（40:60），迷迭香酸色譜峰分離良好。

本試驗以夏枯草中迷迭香酸對照品為對照，進行了方法學考察并建立了含量測定的方法，暫定：本品每袋顆粒，含夏枯草以迷迭香酸（C23H28O11）計，不得少于2.40 mg。