棉籽餅中棉酚降解菌株的分離及脫毒效果初探

李 佳，袁洪水，朱寶成

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001

我國是一個產(chǎn)棉大國，而棉籽餅中粗蛋白含量達(dá)到34%～38%，高出大米和小麥5～8倍[1，2]，可作為一種理想的蛋白質(zhì)飼料，一定程度上彌補(bǔ)我國蛋白飼料資源的不足。但是，棉籽餅中含有游離棉酚，直接利用可引起動物棉酚中毒，給養(yǎng)殖戶造成巨大的損失[3]。因此，對棉籽餅進(jìn)行脫毒處理，從而更高效、更安全的利用棉副產(chǎn)品對于畜牧養(yǎng)殖業(yè)來說意義重大。

本文是從棉田土壤中篩選能夠降解棉籽餅中棉酚的高效菌株，并對其實際應(yīng)用效果進(jìn)行了初步驗證，希望為棉籽餅這一豐富的粗飼料資源能更好的應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)貢獻(xiàn)一份力量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 棉籽餅來源

所用棉籽餅原料是河北保定河間某榨油廠的普通壓榨油餅，在實驗室經(jīng)過粉碎等工序，使其成為細(xì)度為篩孔直徑小于0.25 mm的棉籽餅粉。

1.1.2 培養(yǎng)基

棉酚培養(yǎng)基平板：將棉酚5 g加50mlPDA培養(yǎng)基加入50ml蒸餾水，制成平板。

棉酚培養(yǎng)液：棉酚5 g加入100mlPDA培養(yǎng)液。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：由棉籽餅和玉米粉等成分組成。

生理生化鑒定培養(yǎng)基，PDA培養(yǎng)基見《真菌鑒定手冊》[4]。

1.2 方法

1.2.1 游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

制備棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用間苯三酚法[5]測定各樣品溶液的吸光度。根據(jù)樣品溶液棉酚含量（μg）和測定的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計算。

1.2.2 棉酚降解菌株的初篩

采用常規(guī)涂布法，將土樣稀釋液涂布棉酚培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)。挑取生長較快的菌落并純化。

1.2.3 棉酚降解菌株的復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種于棉酚培養(yǎng)液中，37℃，180r/min搖床培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)液用0.2 μm微孔濾膜過濾。取過濾除菌的發(fā)酵液以間苯三酚法[5]測定其棉酚降解效果。篩選降解效果出現(xiàn)較早且降解活性較高的菌株。

1.2.4 供試菌株的形態(tài)鑒定

將活化后的供試菌株劃線接種于PDA培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。插片培養(yǎng)供試菌株，在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)。

1.2.5 供試菌株的生理生化鑒定

選取了V.P試驗、淀粉水解等生理生化試驗，具體方法見《真菌鑒定手冊》[4]。

1.2.6 供試菌株對棉籽餅中棉酚實際降解能力的初步考察

將活化后的菌株接種含有棉籽餅粉的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)72 h后，以間苯三酚法測定發(fā)酵前后發(fā)酵培養(yǎng)基提取液中棉酚的含量并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線測定

根據(jù)棉酚含量與吸光度值進(jìn)行回歸計算，得回歸方程：y=64.867x+3.5527（R2=0.9964）。

2.2 棉酚降解菌株的篩選

初篩得到菌株16株，經(jīng)復(fù)篩得到1株降解活性較高的菌株，對棉酚的降解率均超過75%。

2.3 菌種的初步鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察

菌株M12菌落初期呈白色，絨毛狀，后期菌落黃色，產(chǎn)黃色孢子，菌絲細(xì)長，基內(nèi)菌絲呈白色絨毛狀，不透明，孢子梗端有孢子囊，布滿孢子，孢子圓形，呈黃色，菌絲有隔。

2.3.2 生理生化鑒定結(jié)果

對菌株進(jìn)行生理生化試驗鑒定，結(jié)果表明：V-P測定、過氧化氫酶試驗、糖醇發(fā)酵試驗、產(chǎn)氨試驗、甲基紅、明膠液化、硝酸鹽還原和淀粉水解試驗呈陽性；硫化氫試驗、苯丙氨酸脫氨酶試驗、檸檬酸鹽利用和吲哚反應(yīng)呈陰性。參照《真菌鑒定手冊》[4]初步確定菌株M12屬于魯氏毛霉（Mucor rourianus）。

2.4 棉籽餅實際脫毒效果的研究

通過供試菌株對棉籽餅的發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)菌株M12脫毒率達(dá)80.1%，棉酚殘余量均不足80 mg/kg，達(dá)到我國國家標(biāo)準(zhǔn)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定（GB13078-2001）：飼料原料棉籽餅中游離棉酚含量≤1200 mg/kg，具有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。

3 討論

目前，常用的棉籽餅脫毒方法有：物理法、化學(xué)法及生物發(fā)酵脫毒。其中物理法和化學(xué)法處理后，棉籽餅產(chǎn)品的營養(yǎng)成分會遭到破壞或流失，同時適口性和采食量也受到了影響[6]。采用微生物發(fā)酵棉籽后，其蛋白質(zhì)和氨基酸顯著提高，適口性增加，同時活細(xì)胞數(shù)也大幅度提高，是非常優(yōu)良的微生物飼料添加劑[7-8]。因此，采用微生物對棉籽餅脫毒是一種低成本、高效率[8]、工藝設(shè)備簡單的脫毒方法，具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

[1]石秀俠，程茂基，蔡克周，等.棉籽餅有毒物質(zhì)及其脫毒方法研究進(jìn)展[J].飼料博覽，2005，6：8-10.

[2]邢志剛，周安國，任花池，等.精氨酸與賴氨酸適宜比例研究進(jìn)展[J].中國飼料，2004，15：11-13.

[3]趙順紅，張文舉.棉籽餅粕生物脫毒的研究進(jìn)展[J].飼料視角，2007，1：54-55.

[4]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979.

[5]敖維平，曲明悅.飼料中游離棉酚快速測定適宜條件的篩選[J].中國飼料，2007，20：24-27.

[6]何濤，滕達(dá)，張海軍，等.微生物降解棉酚的響應(yīng)面分析優(yōu)化[J].生產(chǎn)與科研經(jīng)驗，2008，4（34）：71-74.

[7]張慶華，趙新海，鐘麗娟，等.三菌株協(xié)同固態(tài)發(fā)酵對棉粕脫毒效果及其生物活性的影響[J].飼料工業(yè)，2007，18（28）：37-38.

[8]Nagalakshm I D, Sastry V R B, Pawde A.RumenFementation Pattems and Nutrient Digestion in LambsFed Cottonseed Meal Supplemental Diets[J].AnimalFeed Science and Technology, 2003, 103: 1-4.