二倍體和三倍體虹鱒外周血細胞的比較研究

陳俠君，王炳謙，劉 奕，范兆廷*

（1.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030；2.中國水產科學研究院黑龍江水產研究所，哈爾濱 150070）

虹鱒（Onchorynchus mykiss）屬于鮭形目（Salmoniformes），鮭科（Salmonidae），是世界性的冷水性養殖魚類。由于育性不良或者不育，三倍體魚類可以將能量完全用于營養生長，性成熟后在生長和肌肉質量方面表現出較強的優勢。三倍體育種在鯉鯽雜種及虹鱒、團頭魴、羅非魚、牡蠣、鮑魚和扇貝等水產動物中得到廣泛的應用[1-5]。虹鱒的卵子體積大、胚胎發育時間長，易于進行各種染色體倍性的遺傳操作，三倍體苗種生產容易，易于普及推廣。三倍體虹鱒在幼魚階段時生長速度稍慢，但雌性的性腺不發育，幾乎沒有成熟死亡現象，三倍體虹鱒的個體大，肌肉質量好，可加工為上乘的三文魚；同時三倍體虹鱒對水霉病和傳染性造血器官壞死病（IHN）抵抗力強[6-8]，受到生產者和消費者的青睞。

在對多倍體的血液研究中，往往側重于紅細胞的DNA含量或細胞核體積的測量，對于基因組成倍增加后，紅細胞核的形態發生的變異及變異的原因和構成外周血的主要成分白細胞的變化則罕有研究。文章對二倍體和三倍體虹鱒的紅細胞、白細胞的形態進行了比較分析，以其為豐富虹鱒血細胞形態學、血液生理學、人工誘導三倍體虹鱒以及三倍體虹鱒的鑒定提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

三倍體虹鱒（Onchorynchus mykiss）由中國水產科學研究院黑龍江水產研究所王炳謙課題組通過靜水壓力方法獲得并培育；二倍體虹鱒系同期人工繁殖獲得。二者均飼養于中國水產科學院黑龍江水產研究所渤海冷水魚類實驗站。2008年3月隨機選擇體表無傷、發育正常的三倍體及同期二倍體虹鱒各20尾，其體重及叉長見表1。

表1 試驗用虹鱒基本情況Table 1 Basic circumstance of Onchorynchus mykiss

1.2 方法

用1%肝素浸潤的1 mL注射器從魚尾靜（動）脈采血，制作血涂片，自然風干后用甲醇固定，瑞氏染液染色，清水沖洗干凈，自然干燥。

在光學顯微鏡下觀察各種細胞的形態特征，測量各種白細胞、成熟紅細胞和成熟紅細胞核的長徑（b）與短徑（a）。每個樣本各測量50個細胞，取其平均值，根據公式S=πab/4計算紅細胞和紅細胞核的面積；根據公式V=a2b/1.91計算白細胞、紅細胞和紅細胞核的體積[9]，根據公式核質比=細胞核體積/細胞質體積[10]計算紅細胞的核質比；統計三倍體虹鱒1 000個紅細胞中異常紅細胞的百分比，并對異常紅細胞的種類及所占比例進行分析；計數二倍體和三倍體虹鱒血涂片中的白細胞，并分類。

1.3 數據處理與分析

試驗數據均采用SPSS進行統計學處理，采用t檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 二倍體與三倍體虹鱒紅細胞大小及形態異常紅細胞的比較

二倍體與三倍體虹鱒的紅細胞及核的大小測量結果及二者之間的差異顯著性檢驗結果見表2。

表2 二倍體和三倍體虹鱒紅細胞及其細胞核大小比較Table 2 Comparison on size of erythrocyte and cellular nucleus in diploid and triploid rainbow trout (μm)

由表2可以看出，三倍體虹鱒各項數值都高于二倍體，三倍體虹鱒紅細胞長徑、紅細胞短徑、紅細胞體積、紅細胞面積、核長徑、核體積以及核面積分別為二倍體的1.30、1.11、1.58、1.43、1.38、1.45、1.34倍，差異極顯著（P＜0.01）；三倍體虹鱒紅細胞核短徑與二倍體差異不顯著（P＞0.05）。其中二倍體個體的紅細胞長徑的平均值為 12.12 μm，而三倍體個體的紅細胞長徑的平均值為15.71 μm；三倍體紅細胞短徑/長徑比值為0.57，小于二倍體的比值0.67；三倍體虹鱒和二倍體虹鱒的核質比均為0.82。三倍體虹鱒中63%的紅細胞呈長橢圓形，17%的紅細胞有啞鈴形細胞核或分裂的細胞核，其中啞鈴形紅細胞占所有形態異常紅細胞的47.92%，均等分裂的紅細胞占20.83%，不均等分裂紅細胞占31.25%。本研究中未見二倍體虹鱒的紅細胞有啞鈴形細胞核和分裂的細胞核現象。

2.2 二倍體與三倍體虹鱒的白細胞分類記數及大小比較

由表3可知，虹鱒白細胞構成特點是以血栓細胞為主，其次為淋巴細胞、嗜中性粒細胞，單核細胞極少，沒有發現嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞，其中二倍體和三倍體在淋巴細胞和嗜中性粒細胞上有較大差異。從表4中可以看到，三倍體虹鱒白細胞的長徑和短徑都大于二倍體；嗜中性粒細胞、單核細胞的體積與倍性的1.5：1比例相接近；淋巴細胞、血栓細胞的大小雖然沒有表現出相應的比例，但三倍體虹鱒的淋巴細胞、血栓細胞與二倍體虹鱒相應細胞之間在體積上存在顯著性差異。

表3 白細胞分類計數值Table 3 Differential leucocyte counts（DLC）(%)

表4 二倍體和三倍體虹鱒白細胞大小比較Table 4 Comparison on size of leucocyte in diploid and triploid rainbow trout (μm)

2.3 二倍體與三倍體虹鱒血細胞形態的觀察

2.3.1 紅細胞形態觀察

在二倍體和三倍體虹鱒的血涂片上均可以觀察到原紅細胞、幼紅細胞以及成熟的紅細胞，偶然可見衰老的紅細胞和核影細胞。

兩種倍性虹鱒的原紅細胞呈圓形或近圓形，細胞核也呈圓形，居中，核質比大，染色質成網狀，染成淺紫色，細胞質較少染成淺藍色（見圖版Ⅰ-1、2）；幼紅細胞圓形或略成橢圓形，和成熟的紅細胞形狀相差不大，常成群出現，其核比成熟的紅細胞稍大，圓形或橢圓形，核質比較大，染色質結構疏松，著色較淺，細胞質明顯增多，染成較淺藍色（見圖版Ⅰ-3、4）。

圖版Ⅰ 二、三倍體虹鱒血細胞的形態PlateⅠ Morphology of blood cells in diploid and triploid rainbow trout

無論是三倍體還是二倍體，成熟的紅細胞長橢圓形，表面光滑，核橢圓形，位于細胞中央，染色質致密，核質比小，染成絳紫色，細胞質染成非常淺的藍色（見圖版Ⅰ-5、6）；三倍體中可見到一些異常的紅細胞，有的呈啞鈴狀，細胞質內陷（見圖版Ⅰ-7），有的細胞內有兩個分開的小核，一大一小（見圖版Ⅰ-8），或大小均等（見圖版Ⅰ-9），有的是細胞質已分開但核沒分開（見圖版Ⅰ-10）。

衰老的紅細胞較正常的紅細胞大，核也大，染色質成疏松的網狀，染成淺紫紅色，細胞質著色很淺接近白色（見圖版Ⅰ-11、12）。

核影紅細胞似裸核，染色質疏松網狀，染成淡紫紅色，無細胞質（見圖版Ⅰ-13、14）。

2.3.2 白細胞形態觀察

血栓細胞：細胞極小，是血細胞中最小的細胞，呈圓形、不規則圓形、短棒狀或紡錘形；細胞核占細胞的大部分，呈腎形（見圖版Ⅰ-15、16）、紡錘形（見圖版Ⅰ-17、18）、圓形（見圖版Ⅰ-19、20）或短棒狀（見圖版Ⅰ-21、22）；核中有稠密的染色質，著色很深，染成深紫色；細胞質僅一薄層，或有時不清，繞核零星分布，邊界模糊，淡藍色或透明色。血栓細胞在血涂片中常單個、成隊、數個或數十幾個聚集在一起（見圖版Ⅰ-23、24），在顯微鏡下十分容易辨認。在三倍體中還能觀察到很多啞鈴形的血栓細胞（見圖版Ⅰ-25），另外，三倍體以紡錘形血栓細胞為主，而二倍體以圓形血栓細胞為主。

淋巴細胞：僅比血栓細胞略大，細胞有大有小，多為圓形、腎形或不規則形狀（見圖版Ⅰ-26、27）；多數核有清晰可見的缺刻（見圖版Ⅰ-28）；核染色質濃密，呈粗網狀，著色較深，染成紫色。淋巴細胞核幾乎占據整個細胞，位于細胞中央或與質膜相切；細胞質較少，在核外圍成窄環或僅在核的一側出現，呈弱嗜堿性，染成淡藍色或天藍色；有的邊緣平整，有的可見鈍形的胞質突起。胞質極少的淋巴細胞與裸核狀球形血栓細胞有時很難區分。

嗜中性粒細胞：細胞呈圓形或不規則圓形，邊緣較為平整。核的形狀不十分規則，呈腎形、馬蹄形、螺旋形或分葉形，位于細胞中央，或偏居于細胞一側，常與質膜相切，約占細胞的1/3。核中染色質濃密，染色較深；胞質著色較淺，染成灰藍色，有的細胞能看見其中有微小的藍紫色顆粒。血涂片上，嗜中性粒細胞有時與單核細胞難以區分，但前者胞體較圓，表面較光滑，胞核較小，胞質染色較淡。二倍體和三倍體中均有中有螺旋形（見圖版Ⅰ-29、30）、二分葉（見圖版Ⅰ-31、32）、三分葉形（見圖版Ⅰ-33、34）核嗜中性粒細胞，而二倍體中腎形核嗜中性粒細胞（見圖版Ⅰ-35）、三倍體中有四分葉形（見圖版Ⅰ-36）、馬蹄形（見圖版Ⅰ-37）、桿狀（見圖版Ⅰ-38）核。

單核細胞：在外周血液中數量很少，圓形或近圓形，邊緣較粗糙，核呈不規則的圓形或不規則多邊形，較大，位于細胞中央或偏心位，核中染色質分布疏松，成網狀，胞質豐富，著色較淺，染成灰藍色，有藍紫色顆粒分布（見圖版Ⅰ-39、40）。

3 討論與結論

由于基因組大小的不同，不同倍性細胞核體積比值存在較大的差異。馬濤等報道二倍體與四倍體虹鱒細胞核體積的比值為1：2.42[11]；朱藍菲等在研究人工同源和異源三倍體鰱時，發現同源三倍體紅細胞核體積為二倍體的1.63倍[9]；鰱×鳙及鰱×團頭魴異源三倍體紅細胞核體積則分別是二倍體的2.04倍和1.85倍。俞小牧等則發現異源四倍體、四倍體和倍間三倍體白鯽（Carassius curieri）的細胞核體積分別是二倍體的1.83，1.98和1.43倍，接近理論值2.00倍和1.50倍[12]。本研究結果表明，三倍體虹鱒的核體積約為二倍體的1.5倍，表明通過測量紅細胞核體積能較準確反映出多倍體的倍性。

一般認為，細胞大小與DNA的含量或染色體數量有關。為維持恒定的核質比例，隨著染色體數目增多，多倍體的細胞及細胞核通常要比二倍體大[13]。本研究結果表明，虹鱒三倍體的核體積約為二倍體的1.5倍，并且三倍體和二倍體的紅細胞體積分別為658.50和417.25，比值接近1.5，依倍性增加而且同比例增大。

研究發現三倍體虹鱒的紅細胞形態與二倍體相比發生了一定的變化，有近17%的啞鈴狀或雙核紅細胞。俞小牧等對異源四倍體白鯽及倍間三倍體白鯽的研究也發現異常紅細胞（啞鈴形或雙核）出現率分別為7.6%和10.12%[12]；劉巧等報道的異源四倍體鯽鯉有33%的紅細胞核為啞鈴形、三倍體湘云鯽有25%的紅細胞核為啞鈴形[1]。因此可將該現象作為區別多倍體與二倍體的一個重要標志。虹鱒三倍體中產生異常紅細胞的原因目前尚不能得到合理的解釋，可能是由于三倍體紅細胞存在一些異常無絲分裂，而使得部分紅細胞停留在無絲分裂的不同階段。若要對此現象作出明確的結論，還需要對三倍體魚類造血器官的生理特點以及紅細胞的發生過程進行深入研究，以尋找其組織學和細胞學證據。

虹鱒外周血白細胞中的血栓細胞和淋巴細胞占有相當大的比例，在二倍體和三倍體虹鱒中均未發現嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。在魚類外周血液中是否存在嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞，以往的研究已有較多論述[14-18]。筆者傾向于認為嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞客觀存在，但數量較少，或者我們制片過程中導致了嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞解體而無法得見。

白細胞的主要作用是保護機體，抵御病害的侵襲，在機體的免疫反應中起主要作用[19]。白細胞數量的差別可用于解釋魚類的抗病和在特定環境下的耐受能力。三倍體虹鱒白細胞中嗜中性粒細胞和淋巴細胞都顯著多于二倍體，可能與三倍體抗病能力強有關。

二倍體虹鱒的血栓細胞在血涂片上表現出各種形態：有圓形、腎形、紡錘形、短棒形；除以上形狀外，三倍體虹鱒還有啞鈴形；四倍體鯽鯉的血栓細胞有卵圓形、長桿形、大頭釘形三種形態[1]；歐洲鰻鱺表現為5種形態[20]；這顯示了血栓細胞的形態因種類而異。

Barber等認為許多淋巴細胞的體積是連續變化的，不能用“大”“小”來界定[17]。Ellis指出，將淋巴細胞分為“大”“小”是武斷的，因為它們可能代表了同一種細胞的不同功能狀態，而不大可能是具有不同功能的兩種細胞[18]。因此，有研究者將其歸為一類進行描述[21-23]。但也有人認為它們是具有不同功能的兩類細胞[24-25]。在本試驗中，通過觀察和測量，淋巴細胞的大小和染色深淺有一定的連續性，而且較大者胞質染色較深，這與“未成熟的細胞往往較已成熟者大（巨核細胞系除外）”，“細胞愈年幼，RNA含量愈多，與瑞氏染液中的堿性美藍有親和力，漿染色愈藍”的規律相符合[26]，因此可以認為是淋巴細胞的不同功能狀態，故應歸為一類。

二倍體虹鱒嗜中性粒細胞有腎形、螺旋形、二分葉、三分葉形核，而三倍體中無腎形核、有馬蹄形、螺旋形、二分葉、三分葉，四分葉形核。腎形核、馬蹄形核和四分葉核可作為區分二倍體虹鱒與三倍體虹鱒的另一重要鑒定標志。

由此可知，兩種倍性虹鱒的紅細胞、嗜中性粒細胞、血栓細胞的形態均存在差異，尤其以紅細胞的差異最為明顯。三倍體虹鱒外周血中近17%的紅細胞有啞鈴形細胞核或雙核而二倍體虹鱒中未觀察到這種畸形細胞，因此這種現象可以作為區別三倍體與二倍體的一個重要標志。

[1]劉巧,王躍群,劉少軍,等.不同倍性鯽鯉魚血液及血細胞的比較[J].自然科學進展,2004,14(10)∶1111-1117.

[2]龍強,宗虎民.虹鱒魚三倍體的育種技術[J].北京水產,2004(5)∶36-37.

[3]鄒曙明,李思發,蔡完其,等.團頭魴同源四倍體、倍間三倍體與二倍體紅細胞的形態特征比較[J].中國水產科學,2006,13(6)∶891-895.

[4]Varad K,馮益民.全雌三倍體莫桑比克羅非魚的生產[J].國外水產,1990(4)∶22-24.

[5]王昭萍,姜波,孔令峰,等.利用四倍體與二倍體雜交規模化培育全三倍體太平洋牡蠣苗種[J].中國海洋大學學報,2004,34(5)∶742-746.

[6]馬作析.魚類多倍體及在養殖中應用的可能性[J].現代漁業信息,1991,6(4)∶6-10.

[7]樓允東.魚類育種學[M].北京∶中國農業出版社,1999∶117-152.

[8]Benfey T J,Sutterlin A M.The haematology of triploid landlocked Atlantic salmon,Salmo salar L.[J].J Fish Biol,1984,24∶333-338.

[9]朱藍菲,桂建芳,梁紹昌,等.人工同源和異源三倍體鰱的紅細胞觀察[J].水生生物學報,1992,16(1)∶84-87.

[10]倪海兒,杜立勤.東海鰳.卵巢發育的組織學觀察[J].水產學報,2001,25(4)∶317-322.

[11]馬濤,朱才寶,朱秉仁.熱休克誘導虹鱒四倍體[J].水生生物學報,1987,11(4)∶329-335.

[12]俞小牧,陳敏容,楊興棋,等.人工誘導異源四倍體和倍間三倍體白鯽的紅細胞觀察及其相對DNA含量測定[J].水生生物學報,1998,22(2)∶291-295.

[13]Small S A,Benfey T J.Cell size in triploid salmon[J].Exp Zool,1987,241∶339-342.

[14]趙海鵬,趙海濤,金麗,等.華鯪外周血細胞纖維結構觀察[J].水產科學,2004,24(6)∶24-27.

[15]Thorgaard G H,Gall G A E.Adult triploids in a rainbow trout family[J].Genetics,1979,93∶961-973.

[16]Arai K,Matsubara K,Suzuki R.Production of polypioids and viable gynogens using spontaneously occurring tetraploid loach,Misgumus anguillicaudatus[J].Aquaculture,1993,117∶227-235.

[17]Barber D L,Millis Westermann J E,White M G.Th blood cells of the antarcitic icefish Chaenocephalus aceratus Lonnberg light and electron microscopic abservations[J].Fish Boil,1981,19∶11－28.

[18]Ellis A E.The leucocytes of fish∶A review[J].Fish boil,1977(11)∶453-491.

[19]林浩然.魚類生理學[M].廣州∶廣東高等教育出版社,1999∶82-87.

[20]周玉,郭文場,楊振國,等.歐洲鰻鱺外周血細胞的顯微和超微結構[J].動物學報,2002,48(3)∶393－401.

[21]Roubal F R.Blood and other possible inflammatory cells in the sparid Acanthopagrus australis(Gunther)[J].Fish Biol,1986,28∶573-593.

[22]胡成鈺.鳙魚外周血細胞的細微結構[J].江西科學,1990,8(3)∶20－28.

[23]馮懷亮,李文武,王鐵恒.鯉魚血細胞顯微和亞顯微結構的觀察[J].水產學報,1991,15(3)∶241－244.

[24]Parrott D M V,Desousa M A B.Thymus-dependent and thymusindependent populations.Origins,migratory patterns and life span[J].Clin Exp Immunol,1971(8)∶663-684.

[25]周玉,潘風光,李巖松,等.達氏鰉外周血細胞的形態學研究[J].中國水產科學,2006,13(3)∶480－484.

[26]劉志潔,宗英.野生動物血液細胞學圖譜[M].北京∶科學出版社,2002.