常溫高效纖維素分解菌的篩選

馬懷良，郭文學(xué)，柴軍紅

（1.牡丹江師范學(xué)院生物系，黑龍江 牡丹江 157012；2.牡丹江市綠珠果蔬有限公司，黑龍江 牡丹江 157000）

我國的纖維素資源非常豐富，僅農(nóng)作物秸稈一項，每年可達6～10億t，但由于天然纖維素的復(fù)雜和難降解，人們對它的開發(fā)和利用十分有限[1]。篩選高效纖維素分解菌株是利用纖維素類資源的關(guān)鍵[2]，在食品、飼料、醫(yī)藥、化工、能源等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。但目前應(yīng)用的纖維素分解菌普遍存在酶活力較低，分解速度慢的問題[4-5]，因此篩選高效纖維素分解菌具有重要的意義。

本試驗從長期堆放稻草的土壤中分離出數(shù)纖維素分解菌，并對其纖維素酶活力進行了測定，以期為纖維素酶制劑生產(chǎn)及利用纖維素資源提供優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 濾紙?zhí)幚?/p>

濾紙（巧生牌中速定量濾紙）用1%醋酸浸泡24 h，用碘液檢查確定無淀粉后，2%蘇打水沖洗至中性，晾干，剪成1 cm×6 cm小條待用。

1.1.2 樣品采集

從長期堆放稻草的土壤中，取地下5～25 cm處的樣品裝入預(yù)先滅過菌的三角瓶中，包扎好后取回待用。

1.2 培養(yǎng)基

Hutchison液體培養(yǎng)基[6]：KH2PO41 g，F(xiàn)eCl30.01 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaNO32.5 g，CaCl20.1 g，NaCl 0.1 g，H2O 1 000 mL，pH 7.2～7.4。將液體培養(yǎng)基分裝于150 mL三角瓶內(nèi)，每瓶50 mL，每瓶加入10張濾紙條，121℃滅菌20 min后備用。羧甲基纖維素培養(yǎng)基（CMC）[7]：CMC-Na 15 g，NH4NO31 g，酵母膏1 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，瓊脂 20 g，H2O 1 000 mL。121 ℃滅菌20 min后備用。

1.3 菌種富集、分離、純化

將10 g樣品置于250 mL裝有小玻璃珠的三角瓶中，加入100 mL無菌水，120 r·min-1振蕩10 min。取1 mL懸液加入到盛有Hutchison液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃靜置培養(yǎng)。待濾紙崩解以后，120 r·min-1振蕩10 min，再轉(zhuǎn)接到新鮮的培養(yǎng)液中，接種量為10%，如此轉(zhuǎn)接數(shù)代，淘汰失去分解能力和不穩(wěn)定的培養(yǎng)物[4]。觀察濾紙條斷裂情況，在濾紙條斷裂處挑取培養(yǎng)物在羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上劃線分離，28℃培養(yǎng)獲得單菌落。將單菌落反復(fù)劃線純化，結(jié)合顯微鏡鏡檢，直至純化得到純菌株。

1.4 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶試驗

將篩選的菌株在羧甲基纖維素培養(yǎng)基試管斜面上，28℃活化3 d。將5 mL無菌水滴加到試管斜面中，振蕩，制備成菌懸液。吸取菌懸液1 mL接入盛有Hutchison液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，150 r·min-1的恒溫水浴振蕩器培養(yǎng)7 d。

1.5 纖維素酶活力的測定

1.5.1 粗酶液的制備

取培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液，于4℃、3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，即為粗酶液[8]。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、C1酶活力、羧甲基纖維素酶（CMCase）活力、濾紙酶活力（FPA）測定[9]。

在上述條件下，以國際單位為依據(jù)，定義每分鐘催化纖維素水解生成1 μmol葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（IU），其計算公式為[10]：

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件進行方差分析，顯著性分析采用LSD法。

1.7 菌種鑒定

參照文獻[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素分解菌的篩選及酶活力測定

從土壤中分離出霉菌11株，分別命名NM1～NM11；放線菌1株，命名為NA。將12株纖維素分解菌接入Hutchison液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d后，測定纖維素酶活力。方差分析結(jié)果見表1。菌株間C1酶活力、CMC酶活力、濾紙酶活力差異極顯著。

表1 纖維素酶活力方差分析Table 1 Cellulase activity analysis of variance in different strains

由表2可知，12株纖維素分解菌C1酶活力、CMC酶活力與FPA差異較大，其中NM5的C1酶活力、CMC酶活力、FPA均最高，分解纖維素的能力最強。纖維素酶是一組復(fù)合酶系，由CMC酶活力、C1酶和β-葡萄糖苷三類組分酶組成，微生物分解纖維素的能力取決于這三類組分酶的協(xié)同作用。微生物產(chǎn)生的纖維素酶系是否齊全，不同的纖維素底物誘導(dǎo)效應(yīng)，營養(yǎng)基質(zhì)，培養(yǎng)條件等因素使三類組分酶的含量、比例和活性不同，影響三類組分酶的協(xié)同作用，導(dǎo)致微生物對纖維素分解能力差異較大。另外，不同微生物產(chǎn)生的纖維素酶酶促反應(yīng)具有不同的最適pH和溫度。而在測定纖維素酶活時，pH和溫度是既定的，在此條件下，測定不同微生物產(chǎn)生的纖維素酶活力有高有低，這也是微生物分解纖維素能力差異較大的一個原因。

表2 纖維素酶活力顯著性分析Table 2 Significant difference analysis of cellulase activity in different strains

2.2 菌株NM5鑒定

菌落特征：將NM5接種至PDA培養(yǎng)基上，菌落開始時為白色，棉絮狀，后從菌落中央產(chǎn)生綠色孢子，中央變成綠色，菌落周圍有白色菌絲的生長帶。最后菌落大部分變成綠色。形態(tài)特征：分生孢子梗從菌絲的側(cè)枝上生出，直立，分枝，小枝對生，頂端不膨大，上生分生孢子團，分生孢子球形，無色。

根據(jù)NM5的菌落特征和形態(tài)特征，同時參見文獻[11]，將NM5初步鑒定為木霉菌屬（Trichoderma）。結(jié)果見圖版Ⅰ。

圖版I NM5的菌落特征和形態(tài)特征Plate I Colonial characteristic and morphological characteristic of strain NM5

3 討論

目前國內(nèi)外所選育出來的優(yōu)良纖維素分解菌幾乎都是木霉屬菌株[12]，特別是里氏木霉（T.reesei）[13]。因此可根據(jù)木霉的生長特性、營養(yǎng)需求等因素優(yōu)化培養(yǎng)基進行定向篩選，以獲得分解纖維素更強的木霉菌株。

目前，我國應(yīng)用于生產(chǎn)纖維素酶的菌株的FPA為 100 μmol·g－1·h－1左右[5]，而本試驗篩選的木霉屬菌株NM5采用Hutchison液體培養(yǎng)基發(fā)酵，F(xiàn)PA可達 80.61 μmol·g－1·h－1，如對其進行誘變或產(chǎn)酶條件優(yōu)化，可進一步提高纖維素酶活力，為生產(chǎn)提供優(yōu)良菌株。

在測定纖維素酶活力時，常以CMC酶活力和FPA表示。由于羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）是可溶性的纖維素，而天然的纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不溶于水，因此CMC酶活力并不能真實地反映菌株分解纖維素的能力。而濾紙是聚合度和結(jié)晶度都居中等的天然纖維材料，PFA可表征菌株分解纖維素的能力及其纖維素酶系的協(xié)同作用[14]，因此測定纖維素酶活力應(yīng)以FPA為主。不同廠家生產(chǎn)的濾紙質(zhì)量參差不齊，測定的FPA可比性較差，不利于評價各菌株間分解纖維素的能力差異，因此有必要建立測定FPA專用的、嚴(yán)格的濾紙質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

用Hutchison液體培養(yǎng)基和羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板對采集的樣品進行初篩，篩選出12株常溫纖維素分解菌，并結(jié)合Hutchison液體培養(yǎng)基發(fā)酵試驗，從中篩選出1株分解纖維素能力較強的霉菌NM5，初步鑒定為木霉菌屬（Trichoderma），其C1酶活力、CMC酶活力、FPA分別為0.0170、0.7174、1.3435 IU·mL-1，具有較強的應(yīng)用價值。

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