秋水仙素誘導(dǎo)離體培養(yǎng)越橘多倍體研究

李曉艷，張志東，李亞東，吳 林，劉海廣

（吉林農(nóng)業(yè)大學園藝學院，長春 130118）

多倍體育種是獲得新品種的主要途徑之一，利用秋水仙素處理植株是獲得多倍體的有效方法。多倍體誘導(dǎo)試驗最初多在田間進行，但由于變異細胞往往因?qū)娱g取代而消失。采用試管苗處理可以使獲得的誘變嵌合體在短時間內(nèi)快速大量繼代和分離。越橘屬于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium），是一類富含營養(yǎng)的小漿果。關(guān)于秋水仙素誘導(dǎo)越橘多倍體研究目前在國內(nèi)未有相關(guān)報道，國外的研究對誘變材料的鑒定僅限于根尖染色體計數(shù)和形態(tài)方面的觀察[1-2]。本試驗通過秋水仙素處理對越橘試管苗進行誘導(dǎo)，并對變異株系進行了篩選。越橘多倍體材料的獲得將為培育越橘多倍體新品種奠定基礎(chǔ)，為今后越橘品種選育提供親本材料，對指導(dǎo)果樹倍性育種具有重要的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料

采用3個越橘品種的組培苗：美登（Blomidon）、達柔（Darrow）、埃利奧特（Elliott）。以上3個品種為已知二倍體（2n=2x=24）[3-5]，均來自吉林農(nóng)業(yè)大學小漿果研究所。

培養(yǎng)基為改良的WPM基本培養(yǎng)基，添加玉米素（Zeatin，ZT） 0.7 mg·L-1，蔗糖 3%，瓊脂 0.7%，pH 5.4。培養(yǎng)基在121℃，1.1 kg·cm-2壓力下高溫滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為23±2℃，光照強度為2 000 lx，光周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 方法

1.2.1 藥劑培養(yǎng)基法

將生長健壯的無菌試管苗剪去頂端，促進腋芽萌發(fā)，4～6 d后將試管苗剪成帶葉的單芽莖段，轉(zhuǎn)接到含有秋水仙素的WPM+ZT 2.0 mg·L-1培養(yǎng)基中。秋水仙素濃度設(shè)5個水平：0%（對照）、0.001%、0.002%、0.003%、0.005%。培養(yǎng)30 d左右，待處理的腋芽萌動抽莖長至1～2 cm后繼代到不含秋水仙素的新鮮培養(yǎng)基中。

1.2.2 浸漬法

將生長健壯的無菌試管苗剪去頂端，促進腋芽萌發(fā)，4～6 d后將試管苗剪成帶葉的單芽莖段，浸泡在經(jīng)高壓滅菌的0（對照）、0.05%、0.1%、0.2%秋水仙素水溶液中，然后放在搖床上以100 r·min-1震蕩，處理時間分別為6、12和24 h。在超凈工作臺上將材料從秋水仙素水溶液中取出，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分后，將單芽莖段轉(zhuǎn)接到不含秋水仙素的培養(yǎng)基中。待處理的腋芽萌動抽莖長至1～2 cm后繼代到新鮮的培養(yǎng)基中。

1.3 變異材料檢測

1.3.1 鏡檢

采用根尖常規(guī)壓片進行染色體的觀察，染色液選用鐵礬-蘇木精[6]。待越橘試管苗在生根培養(yǎng)基（1/2WPM+IBA 0.2 mg·L-1+活性炭 1 g·L-1）中的根長到0.5～1.0 cm左右進行壓片鏡檢。選擇染色體分散好的細胞在OLYMPUS顯微鏡下觀察并拍照。每種材料觀察30個以上的中期分裂細胞。

1.3.2 流式細胞光度法鑒定

參照Dolezel等利用流式細胞儀檢測染色體的方法[7]。每個品種重復(fù)3次，以達柔為對照。采用美國B-D公司的B-D FACSCalibur流式細胞儀測定、分析細胞倍性。

存活率（%）=（成活個數(shù)/接種個數(shù)）×100%

變異率（%）=（變異個數(shù)/成活個數(shù)）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 藥劑培養(yǎng)基法對越橘試管苗莖段誘導(dǎo)多倍體的影響

在本研究中3個供試越橘品種表現(xiàn)出相同的變化趨勢，即在不添加秋水仙素的培養(yǎng)基中存活率都在90%以上，而只加入0.001%的秋水仙素存活率就大副下降，埃利奧特只加濃度為0.001%秋水仙素存活率由對照95.7%下降到30.0%，但沒有檢測出染色體加倍的細胞。秋水仙素濃度為0.003%和0.005%的處理中，因濃度高出現(xiàn)明顯的藥害作用。從存活率和變異率兩方面考慮，本研究認為秋水仙素濃度為0.002%處理效果較好，結(jié)果見表1。

表1 秋水仙素藥劑培養(yǎng)基法對越橘3個品種誘導(dǎo)多倍體的影響Table 1 Effect of medium with colchicine on polypoid induction of three blueberry cultivars

由表1可知，在對不同越橘品種處理效果方面，埃利奧特好于達柔，達柔好于美登。通過對達柔和埃利奧特2個品種第一次繼代處理材料進行根尖染色體鑒定，變異率不到8.0%。由于變異細胞較少，在第二次繼代培養(yǎng)后沒有發(fā)現(xiàn)變異植株。

2.2 浸漬法對越橘試管苗莖段誘導(dǎo)多倍體的影響

在秋水仙素濃度0.05%的浸漬處理中，除美登在24 h浸漬處理中得到變異植株外，其他品種在6、12和24 h均沒有得到變異植株。在0.1%的處理中，3個供試品種誘變效果較好，尤其是在24 h浸漬處理中得到了較高的變異率（見表2）。在0.2%的處理中，隨著浸漬時間的延長，存活率和變異率都明顯下降。從存活率和變異率兩方面考慮，本研究認為秋水仙素濃度為0.1%，浸漬24 h效果最好。

從表2中可知，不同的越橘品種表現(xiàn)出相同的變化趨勢。即在時間一定的情況下，存活率呈直線下降，而變異率則呈單峰曲線。綜合3個品種的處理結(jié)果來看，達柔的誘導(dǎo)效果最好，在秋水仙素濃度為0.1%，浸漬處理24 h的試驗組合中，存活率為28.9%，變異率22.6%。對得到的變異植株進行繼代培養(yǎng)，并對其后代進行鑒定。

表2 不同秋水仙素濃度浸漬24 h對不同品種單芽莖段誘導(dǎo)多倍體的影響Table 2 Effect of different colchicine concentration and soaking 24 h on polypoid induction of mutation from blueberry buds

2.3 細胞學鑒定比較

2.3.1 根尖細胞染色體計數(shù)

對所獲得的3個品種誘變株系進行根尖染色體鑒定（見表3）。第一次繼代的8個株系全為嵌合體，無一株是同質(zhì)四倍體。從整體上看，幾乎所有異常株系染色體加倍細胞比例均較低，變動幅度13.2%～36.4%之間。其中最高是達柔，誘變株系染色體加倍細胞為36.4%，二倍體細胞占多數(shù)（見圖1）。

表3 秋水仙素浸漬單芽莖段誘變株系倍性鑒定Table 3 Chromosome variation of mutational lines induced by soaking buds in colchicine liquid

圖1 達柔組培苗根尖染色體計數(shù)Fig.1 Chromosomes of root-tip cell in Darrow

2.3.2 流式細胞光度法鑒定

結(jié)果見圖2。

利用流式細胞儀對植物細胞倍性進行檢測，橫座標是所測的熒光或散射光的強度，用“道數(shù)”（Channel No.）來表示，其值與細胞內(nèi)DNA含量成正比。縱座標表示被測細胞的絕對數(shù)目。對變異株系進行DNA含量測定，達柔對照二倍體植株只有一個主峰，位于橫坐標大約50的位置。變異株有兩個主峰，第一個峰的位置與對照相同，第二個峰的位置是對照峰值的二倍。由于熒光強度與細胞內(nèi)DNA含量成正比，說明經(jīng)秋水仙素浸漬誘導(dǎo)的變異株系體內(nèi)含有兩種DNA含量的細胞，即二倍體和四倍體細胞的嵌合體。在嵌合體中，二倍體細胞占優(yōu)勢，這與根尖染色體壓片所得結(jié)果一致。

圖2 越橘達柔變異植株DNA含量分析Fig.2 DNA content distribution of mutational Darrow plant

3 討論與結(jié)論

試驗中選用了兩種秋水仙素處理材料的方法，但藥劑培養(yǎng)基法處理效果不如浸漬法。浸漬法誘導(dǎo)在本試驗中獲得了變異株系，其中達柔品種最高變異率達22.6%。本研究認為誘導(dǎo)處理中保證植株良好的生長狀況、創(chuàng)造細胞分裂的最佳生長條件、選擇適宜的秋水仙素濃度和作用時間，是誘導(dǎo)多倍體成功的關(guān)鍵。王娜等用50 mg·L-1秋水仙素處理40 d誘導(dǎo)酸棗和冬棗，得到了同質(zhì)的四倍體[8]。劉慶忠等將皇家嘎拉蘋果離體新梢的葉片放入含0～200 mg·L-1秋水仙素的液體分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，獲得四倍體植株[9]。

在誘導(dǎo)植物多倍體時，嵌合體是一種常見的現(xiàn)象。韓禮星等在誘導(dǎo)獼猴桃多倍體研究中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后代全部為嵌合體[10]。馬愛紅等在進行四倍體葡萄誘導(dǎo)的試驗中得到了二倍體和四倍體的嵌合體[11]。本研究通過根尖進行染色體鑒定，發(fā)現(xiàn)變異株系多為二倍體和四倍體的嵌合體。利用流式細胞儀對DNA含量進行檢測也證明誘變材料后代均為嵌合體。如何進行越橘誘變株系嵌合體的分離和純化將是下一步研究的重點。

利用流式細胞儀檢測植物細胞倍性是近幾年在我國興起的一項新技術(shù)。本試驗對越橘組培苗變異株鑒定采用根尖染色體計數(shù)和流式細胞儀測定DNA含量相結(jié)合的方法，鑒定結(jié)果一致，說明流式細胞儀檢測方法可靠。李等將流式細胞光度術(shù)用于草莓倍性的鑒定，結(jié)果也證明隨著倍性水平的增加細胞核DNA含量隨之成倍增加[12]。張俊娥等采用倍性分析儀成功地鑒定了柑橘愈傷組織的遺傳變異[13]。但由于越橘試管苗單株小，單株重達不到流式細胞儀測試用量（約0.5～1.0 g），故測試結(jié)果只能反應(yīng)群體試管苗的倍性，不能反映越橘試管苗單株的倍性。所以采用根尖壓片法和流式細胞儀分析相結(jié)合的方法鑒定越橘試管苗倍性是必要的。

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[7]Dolezel J,Binarovā P,Lucrettr S.Analysis of nuclear DNA content in plant cells by flow cytometry[J].Biol Plant,1989,31∶113-120.

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[9]劉慶忠,趙紅軍,劉鵬.秋水仙素處理離體葉片獲得皇家嘎拉蘋果四倍體植株[J].果樹學報,2001,18(1)∶7-10.

[10]韓禮星,趙改榮,李玉紅.獼猴桃多倍體誘導(dǎo)研究[J].果樹科學,1998,15(3)∶273-276.

[11]馬愛紅,范培格,孫建設(shè).四倍體葡萄誘導(dǎo)技術(shù)的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2005,38(8)∶1645-1651.

[13]張俊娥,劉繼紅,鄧秀新.采用倍性分析儀鑒定柑橘愈傷組織的遺傳變異[J].遺傳學報,2003,30(2)∶169-174.