旋毛蟲Ts43基因在各感染時期的轉錄水平上差異表達

宋銘忻,路義鑫,王守育,張子群,暢 丹,韓彩霞

(1.東北農業大學動物醫學學院,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江出入境檢驗檢疫局,黑龍江 哈爾濱 150030)

旋毛蟲(Trichinella spiralis)是一種感染宿主骨骼肌細胞的寄生蟲。旋毛蟲新生蚴鉆入宿主骨骼肌細胞后,會導致其去分化,從而改造肌細胞,使之形成保姆細胞(nurse cell,NC)。保姆細胞可為旋毛蟲提供營養,并具有免疫逃避的作用。許多學者認為旋毛蟲保姆細胞的形成與旋毛蟲43 ku～50 ku排泄-分泌(ES)抗原有關[1]。Ts43基因是43ku ES抗原蛋白的表達基因,其全長cDNA由美國研究者Vassilatis D K(1992)首先發現,為旋毛蟲肌幼蟲特異性表達基因[2]。本研究通過熒光定量PCR技術對旋毛蟲各時期蟲體Ts43基因表達進行定量分析,從而進一步探討Ts43基因與保姆細胞形成的相關性。

1 材料與方法

1.1 蟲種和質粒 旋毛蟲蟲種、質粒pMD18-TTs43和pMD18-T-18S為東北農業大學動物醫學學院寄生蟲病學教研室保存。

1.2 熒光定量PCR引物和探針的設計 根據GenBank中已發表的旋毛蟲Ts43和18S rRNA(登錄號分別為M95499和U60231)序列,設計并合成引物和探針:

Ts43的引物序列和探針為FP:5′-ACAT TT TTCTTAGTGCTT TCTGGGT-3′;RP:5′-ACCATTCTGTATCATCTGTAGCAGTTCT-3′;PROBE:5′-TGCACAACTGTTTGCAAATTCATGCAGC-3′。

18S rRNA的引物序列和探針為 FP:5′-AGGTTCGAAGGCGATCAGATAC-3′;RP:5′-CTGCTCG CCGAGTCTTAAATG-3′;PROBE:5′-CCAACCAGC-GAT TCGCCGAAGT-3′。

1.3 旋毛蟲不同寄生時期蟲體的收集 參考文獻[3-4]的方法,在小鼠感染旋毛蟲肌幼蟲7 d后收集成蟲(AW),并取適量成蟲體外培養收集新生蚴(NBL),于感染后14、18 d和22 d收集成囊前期幼蟲(PEL),于感染后 26、30、34、38、48 d 和 58 d 收集旋毛蟲肌幼蟲(ML)。將收集到的旋毛蟲各時期蟲體,用DEPC水洗滌3次,-20℃凍存備用。

1.4 旋毛蟲總RNA和cDNA文庫的制備 旋毛蟲總RNA抽提按試劑盒說明進行。反轉錄合成cDNA后做18S rRNA的PCR,判斷逆轉錄是否成功。

1.5 熒光定量PCR靈敏性、穩定性和重復性的檢測 對1ng的pMD18-T-Ts43和pMD18-T-18S質粒進行10倍梯度稀釋,分別用熒光定量PCR檢測,根據Ct值來檢測方法的靈敏性。對10-3ng的標準品分別做5個反應管檢測比較同一次反應不同反應管間的批內變異及重復5次檢測比較不同時間的反應結果的批間變異。

1.6 標準曲線的制備及 Ts43基因的表達水平的檢測 用紫外分光光度計測質粒 pMD18-T-Ts43和pMD18-T-18S的濃度后取1 ng/μ L的質粒依次進行10倍的梯度稀釋,分裝為10-1～10-5ng/μ L作為標準品。將標準品的起始拷貝數取對數作為橫坐標,其所對應的Ct值作為縱坐標,即可做出標準曲線。將旋毛蟲各時期蟲體的cDNA作為模板進行熒光定量PCR,獲取相應的Ct值。根據Ct值以及標準曲線計算定量結果。

2 結果

2.1 旋毛蟲各時期蟲體cDNA的PCR鑒定 對PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,結果顯示,旋毛蟲各時期蟲體的18S rRNA目的片段均在100 bp略下方,與設計的內標基因擴增產物91 bp大小一致(見圖1)。

圖1 各寄生時期蟲體cDNA文庫的PCR鑒定

2.2 熒光定量PCR的靈敏度、穩定性和重復性的檢測 質粒pMD18-T-T s43和pMD18-T-18S的檢測下限均為 10-8ng/μ L。對 10-3ng/μ L的質粒pMD 18-T-Ts43作5個反應管檢測,同一次反應不同反應管的批內變異系數為2.0%,不同時間的反應結果的批間變異系數為3.5%,說明本方法的穩定性和重復性都很好。

2.3 標準曲線的制備 T s43基因的標準曲線為Y=-3.390X+13.451,一致系數為 0.999;18S rRNA的標準曲線為 Y=-3.246X+16.396,一致系數為0.992。結果顯示兩條標準曲線的斜率都接近理想值-3.322,一致系數都接近1.000,說明擴增效率均較好(見圖2和圖3)。

2.4 旋毛蟲各時期蟲體Ts43基因表達水平的檢測 根據Ct值計算出旋毛蟲各時期蟲體T s43基因相對于107copies 18S rRNA的拷貝數(見表1)。旋毛蟲在各寄生時期均有Ts43基因的表達,成蟲和新生蚴的Ts43基因表達量相對于其他寄生時期的蟲體很低,該基因表達量在感染后18 d開始逐漸上升,于感染后30 d達到高峰,而后開始逐漸下降,但至感染后58 d的蟲體T s43基因表達水平仍高于成蟲和新生蚴。

表1 不同寄生時期旋毛蟲Ts43基因的定量

3 討論

許多學者在研究旋毛蟲保姆細胞的形成機制時,都注意到了ES抗原的重要作用。Despommier D等[5]用層析聚焦法在 ES抗原中發現了一種43 ku蛋白,它存在于感染后9 d的保姆細胞的胞漿、核質以及表皮上,表明其參與肌肉細胞的轉化。Vassilaits D K等[6]制備了具有螺旋-環-螺旋樣結構的43 ku重組蛋白抗原,認為其可能具有調節宿主骨骼肌細胞基因表達的功能。Jasmer D P等[7]構建了旋毛蟲43 ku蛋白的表達質粒pMYCTsp43,并轉染到鼠成肌細胞C2C12,結果表明該表達質粒對轉染的成肌細胞具有明顯的毒性而無去分化作用。在這之前,Vassilaits D K等[6]也認為43 ku蛋白并沒有直接參與旋毛蟲保姆細胞的形成,而是與43 ku蛋白相關的一系列蛋白參與了骨骼肌的去分化和保姆細胞的形成。至今關于43 ku蛋白是否與保姆細胞的形成有關還在爭論中。

宋銘忻等[8]認為旋毛蟲在小鼠骨骼肌中最早形成保姆細胞時間在感染后16 d,于感染后37 d所有肌幼蟲都形成保姆細胞。本研究結果表明,T s43基因的表達量正是在感染后18d開始增加,在感染后30 d達到峰值,隨后開始逐漸下降,到感染后38 d之后表達量基本維持在一個相對較低的水平,這與保姆細胞形成的時間基本一致[8]。這一現象說明Ts43基因的表達很可能與保姆細胞的形成有關系。此外,本研究中的Ts43基因在成蟲和新生蚴中也有少量的表達,這與之前報道的Ts43基因表達具有期特異性有所不同[6,9]。Vassilaits D K等[6]采用RT-PCR的方法檢測感染旋毛蟲肌幼蟲后9、10、11 、12、13、14 、15 d 和 21 d 的小鼠骨骼肌 ,在感染后11 d才發現T s43基因的表達。Wu Z L等[9]采用半定量RT-PCR法對旋毛蟲的成蟲、新生蚴進行基因定量,發現成蟲、新生蚴都無Ts43基因的表達。出現上述不同的試驗結果可能與各自所用的研究方法、儀器設備和引物等因素有關,這還有待做進一步的深入研究。

總之,本研究結果可以初步確定T s43基因的表達與保姆細胞的形成有較大關系,為進一步研究Ts43基因表達對小鼠骨骼肌細胞基因的影響提供了理論基礎。

[1]Robinson M W,Connolly B.Proteomic analy sis of the ex cretory-secretory proteins of the Trichinella spiralis L1 larva,a nematode parasite of skeletal muscle[J].Proteomics,2005,5(17):4525-4532.

[2]Vassilatis D K,Despommier D D,M isek D E,et al.Analysis of a 43-Ku glycoprotein from the intracellular parasitic nematode T richinella spiralis[J].J Biol Chem,1992,267:18459-18465.

[3]史曉紅,石磊,竇蘭清,等.旋毛蟲成蟲新生幼蟲及肌幼蟲的收集方法[J].中國獸醫科技,1993,23(12):26-27.

[4]張榮光,王中全,尹清源.旋毛蟲成囊前期幼蟲收集方法的研究[J].河南預防醫學雜志,1998,9(4):192-194.

[5]Despommier D,Gold A,Busk S.Trichinella spiralis secreted antigen of the infective L1 larvae localizes to the cy toplasm and nucleoplasm of infected host cells[J].Ex p Parasitol,1990,71:27-38.

[6]Vassilatis D K,Polvere R I,Despommier D D,etal.Developmental expression of a 43 Ku secreted g lycoprotein from Trichinella spiralis[J].Mol Biochem Parasitol,1996,78(1-2):13-23.

[7]Jasmer D P,Kwak D.Fusion and differentiation of murine C2C12 skeletal muscle cells that express Trichinella spiralis p43 protein[J].Exp Parasitol,2006,112(2):67-75.

[8]宋銘忻,張桂紅,路義鑫.毛形線蟲各隔離種保姆細胞形成時間的研究[J].中國獸醫寄生蟲病,2002,10(1):9-11.

[9]Wu Z L,Nagano I,Nakada T,et al.Expression of excretory and secretory protein genes of Trichinella at muscle stage differs before and after cyst formation[J].Parasitol Int,2002,51(2):155-161.