神經內分泌因子對新生犢牛肝細胞MTP mRNA豐度的影響

陳仕均,唐海蓉,劉興友,劉開永

(1.河南科技學院實驗中心,河南 新鄉 453003;2.河南科技大學食品與生物工程學院,河南 洛陽 471003)

微粒體甘油三酯轉運蛋白(M TP)是繼載脂蛋白B(apoB)之后發現參與 TG轉運及VLDL組裝的內質網腔內蛋白,是一種重要的脂質轉運蛋白。MTP主要作為載體在內質網腔與含脂蛋白的apoB等脂類結合以VLDL的形式轉運出肝臟,對含脂蛋白的apoB裝配和分泌起關鍵作用[1]。研究表明,MTP、apoB100、apoE和可溶性LDLR等蛋白質是肝脂轉運的調節蛋白[2]。肝臟MTP的活性、基因表達狀態是控制VLDL合成、裝配和分泌速率的重要因素[3-4]。鼠肝 MTP mRNA過量表達導致肝VLDL分泌增加的研究表明,在正常狀態下,MTP是肝VLDL組裝和分泌過程的限制性因素[3]。MTP活性也可能是泌乳奶牛和嚴重脂肪肝奶牛VLDL的分泌速率的一個重要因子[2-4]。有關胰島素、胰高血糖素,特別是瘦蛋白等神經內分泌因子對奶牛肝細胞 MTP基因表達的調節作用尚不太清楚。為此,本試驗在原代培養的新生犢牛肝細胞培養液中添加胰島素、胰高血糖素和瘦蛋白,應用已建立的半定量RT-PCR方法檢測犢牛肝細胞中MTP mRNA豐度變化,為揭示這些神經內分泌因子調控奶牛肝VLDL組裝與轉運的分子機制,防制奶牛脂肪肝奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞原代培養,參照相關文獻[6-7]進行。按每孔1×106個細胞接種于6孔板,每孔加入2mL分化培養基,于37℃,5%CO2培養箱中培養,4 h細胞完全貼壁后吸出培養基,加入2mL試驗培養基,培養12 h后,在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,然后添加胰島素、胰高血糖素和瘦蛋白繼續培養24 h。

1.2 肝細胞MTP mRNA豐度的半定量RT-PCR檢測 取接種于6孔培養板中培養12h生長良好的肝細胞,設5個不同濃度組(1為對照組,2～5為試驗組),每組分別添加不同濃度的胰島素(0、1、10、100 nmol/L 和 1000 nmol/L)、胰高血糖素(0、1、10、100 nmol/L 和1000 nmol/L)和瘦蛋白(0、2.5、5.0、10μg/L 和 50μg/L),每個濃度組設 3 個重復,培養24 h后,提取細胞總RNA。根據測定的RNA濃度調整總RNA的體積,使每個添加物中樣品的RNA濃度相同。取相同濃度的RNA進行反轉錄反應合成cDNA,取相同量的cDNA按上述PCR體系和反應條件分別擴增MTP和β-actin基因目的片段。RT-PCR反應后產物進行瓊脂糖凝膠電泳,電泳圖片用凝膠成像分析軟件計算密度(強度×面積)比例,進行統計學分析。

1.3 統計分析 應用SPSS 10.0軟件對所得數據進行分析,差異顯著性用ONE-WAY ANOVA方差分析,進行Duncan′s LSD檢驗。

2 結果

2.1 胰島素對肝細胞MTP mRNA豐度的影響表1可見,隨著胰島素濃度的升高,肝細胞 MTP mRNA 豐度(MTP/β-actin灰度比值)不斷降低,呈現明顯的線性關系,除10 nmol/L與100 nmol/L之間無差異外,其他濃度組間差異顯著(P＜0.05);各胰島素濃度處理組和對照組MTP mRNA豐度也差異顯著(P＜0.05)。結果表明,胰島素對肝細胞MTP mRNA表達具有抑制作用,顯著抑制了肝細胞MTP mRNA表達水平,隨劑量增加其抑制作用增強,呈現劑量依賴性。

表1 神經內分泌因子對體外培養肝細胞MTP mRNA豐度比較

2.2 胰高血糖素對肝細胞MTP mRNA豐度的影響 隨著胰高血糖素濃度的升高,肝細胞 MTP mRNA豐度逐漸下降,呈明顯的線性關系,不同濃度組之間差異顯著(P＜0.05);各胰高血糖素濃度處理組MTP mRNA豐度均極顯著高于對照組(P＜0.01),見表1。結果表明,胰高血糖素對肝細胞MTP mRNA表達具有抑制作用,顯著地抑制了肝細胞MTP mRNA表達水平,呈現劑量依賴性增強。

2.3 瘦蛋白對肝細胞MTP mRNA豐度的影響由表 1可見,隨著瘦蛋白濃度的升高,肝細胞MTP mRNA 豐度先 增強后減弱 ,除 2.5μg/L和10μg/L之間無差異外,其他不同濃度差異極顯著或差異顯著(P＜0.01或P＜0.05);對照組和各瘦蛋白濃度處理組MT P mRNA豐度也差異極顯著或差異顯著(P＜0.01或P＜0.05)。結果表明,瘦蛋白對肝細胞MTP mRNA表達具有低劑量促進而高劑量抑制的作用,且均呈現劑量依賴性,這種雙重作用直接影響MTP mRNA表達水平。

3 討論

3.1 胰島素影響肝細胞MTP mRNA豐度 胰島素調節牛肝細胞的代謝,胰島素在體內調節MTP基因表達中發揮重要作用,是肝MTP基因轉錄的負調節因子[8-9]。Bremmer D R等[4]檢測營養和激素狀態對非泌乳荷斯坦奶牛肝和牛原代培養肝細胞中MTP基因表達、活性的影響研究結果表明,在體內肝TG、胰島素可能影響肝MTP mRNA水平。體外試驗也證實TG累積、胰島素、高血糖素可影響肝MTP mRNA的豐度,但是對MTP的數量和活性沒有影響[3]。人肝癌細胞系用10 nmol/L胰島素孵育6 h,與未加胰島素組相比,MTP mRNA水平降低了大約30%,胰島素通過抑制肝MT P mRNA轉錄,減低了 apoB100與脂質的結合,從而抑制VLDL的組裝和分泌[10-11]。本試驗結果也證實,胰島素對肝細胞MTP mRNA表達具有抑制作用,顯著抑制了肝細胞MT P mRNA表達水平,隨劑量增加其抑制作用增強,呈現劑量依賴性。這表明胰島素是奶牛肝細胞MTP mRNA表達的抑制因子。

3.2 胰高血糖素影響肝細胞MTP mRNA表達培養液中添加胰高血糖素可調節體外培養牛肝細胞代謝[8]。對鼠的研究表明,胰高血糖素增加溶酶體酸性脂肪酶的活性和apoB100基因的表達[12],因此可直接促進細胞內儲存的TG的水解和VLDL的組裝和分泌。胰高血糖素抑制脂蛋白的組裝和分泌,而且已經在鼠的肝細胞原代培養試驗中得到了證實[13]。體外試驗證實 TG累積、胰島素、高血糖素可影響肝MTP mRNA的豐度,但是對MT P的數量和活性沒有影響[3]。目前尚未見有關胰高血糖素調控肝MTP mRNA表達的報道。本研究結果顯示,胰高血糖素對肝細胞MTP mRNA表達具有抑制作用,且呈劑量依賴性,胰高血糖素可能抑制MTP基因表達,減低中性脂質向內質網腔的轉運從而影響VLDL組裝與分泌率,調節肝脂轉運。

3.3 瘦蛋白可促進和抑制肝細胞MTP mRNA豐度 本試驗結果表明,瘦蛋白對肝細胞MTP mRNA豐度具有低劑量促進而高劑量抑制的雙重作用,呈現劑量依賴性。在靜脈注射瘦蛋白2 h后,大幅度降低鼠肝TG水平,肝脂肪酸氧化和生酮作用增加,同時肝 TG分泌降低[14]。表明瘦蛋白在VLDL的組裝、分泌及代謝中具有重要的調節作用。目前研究還沒有瘦蛋白對奶牛肝MTP mRNA表達調節作用的報道。Luo G等[15]在研究瘦蛋白對人肝癌細胞系apoM轉錄調節中得出瘦蛋白并未顯著影響肝apoB100和apoE mRNA表達的結論。

4 結語

胰島素、胰高血糖素和瘦蛋白影響體外培養的新生犢牛肝細胞MTP mRNA的表達,可通過促進或抑制MTP mRNA表達,促進或抑制VLDL組裝與分泌率,進而調節肝脂轉運。但奶牛肝細胞MTP mRNA表達對VLDL的組裝和分泌的調節作用還有待研究。

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