全反式維甲酸對兔頸動脈粥樣硬化斑塊中細胞凋亡及p53的影響

王國棟,張冬,郭英華,董果雄

動脈粥樣硬化所致心腦血管疾病是當前主要死因之一。血管細胞凋亡可減少細胞成分在血管內膜積蓄、清除炎癥細胞及減少泡沫細胞形成。全反式維甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)作為一種維生素A類衍生物,可抑制血管平滑肌細胞(VSMC)增殖[1],從而減輕動脈狹窄。本實驗研究AT RA對兔頸動脈動粥樣硬化斑塊是否有抑制作用及其是否促細胞主動凋亡。

1 材料和方法

1.1 材料 試劑與儀器:AT RA:上海第六制藥廠,生產批號:030401;膽固醇:上海生物制劑公司;TUNEL凋亡試劑盒、p53一抗及通用型二抗三抗:中山生物技術有限公司;VIDAS計算機圖像分析系統:德國歐波同公司。

分組:新西蘭大白兔40只,體重(2.50±0.25)kg,雌雄不限(購于山東藥檢所,許可證號:魯動質字2002012),隨機分為4組:正常組(n=4)、假手術組(n=12)、手術組(n=12)、治療組(n=12)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及用藥 除正常組外,各組動物均給予6%豬油、1.5%膽固醇及92.5%基礎飼料喂養。2周后按Fishman方法[2]施行頸動脈內膜空氣干燥術:兔靜脈麻醉后,分離右頸總動脈(長約2.5 cm),兩端動脈夾臨時阻斷血流。用流量為250 ml/min的氣流灌注,歷時8 min造成內皮干燥,然后恢復血流,止血、縫合。術后肌注青霉素4×105U/d。假手術組只切開,不進行空氣干燥;術前1 d,治療組給予ATRA 20 mg灌胃,手術組給予等量植物油灌胃。術后第2、4周處死動物,取目的血管待檢。

1.2.2 取材、病理染色 取右側頸總動脈進行HE染色。顯微鏡下進行形態學觀察,并行計算機圖像分析,計算內膜、中膜面積及內膜與中膜面積比例(I/M)。

1.2.3 凋亡細胞及p53檢測 TUNEL法細胞凋亡測定按照凋亡試劑盒說明操作,TUNEL陽性細胞為棕黃色核染,TUNEL陽性細胞數占全部細胞數的比例為細胞凋亡率。p53一抗稀釋濃度為1∶200,其余操作按照免疫組化步驟進行。p53陽性細胞核顯示棕黃色顆粒。

1.3 統計學方法 使用SPSS 11.5軟件進行統計學分析。實驗數據用(±s)表示,采用t檢驗。

2 結果

手術過程中,實驗兔因空氣栓塞死亡1只。高脂飲食兔血清中膽固醇和甘油三酯的平均水平為(48.45±10.36)mmol/L和(11.94±3.71)mmol/L,顯著高于正常組(12.27±2.14)mmol/L和(0.76±0.19)mmol/L(P＜0.001)。

2.1 HE染色 正常組和假手術組兔頸動脈內膜無明顯細胞增殖,只有單層內皮細胞覆蓋。術后2周,手術組和治療組均有平滑肌細胞增生,內膜增厚。4周時手術組內膜增生更加明顯,可見內皮下泡沫細胞,出現粥樣硬化斑塊、管腔狹窄;而治療組內膜增生不明顯,管腔無明顯狹窄;治療組和手術組內膜(I)、中膜(M)面積及I/M比見表1。

2.2 細胞凋亡 正常組和假手術組血管TUNEL染

色僅偶見陽性細胞著色。術后第2周,手術組和治療組血管內膜下可見部分胞核呈棕黃色陽性著色,細胞凋亡率均明顯高于假手術組(P＜0.01);血管中層可見少量TUNEL陽性細胞。第4周,手術組TUNEL陽性細胞比例較第2周時減少,而治療組TUNEL陽性細胞數仍表達較多,細胞凋亡率明顯高于手術組(P＜0.01)。見表2。

2.3 p53表達 正常組和假手術組偶見陽性細胞表達;第2周和第4周時,治療組和手術組p53陽性細胞比例均明顯高于假手術組(P＜0.01);第2周時,治療組陽性細胞比例同手術組類似(P＞0.05),第4周時明顯高于手術組(P＜0.01)。見表2。

表1 兔頸動脈內膜、中膜面積測定(mm2)

表2 TUNEL、p53免疫組化陽性率(%)

3 討論

本實驗中,高脂飲食兔的頸總動脈在空氣干燥術后4周,可見內膜下增厚、管腔狹窄,說明動脈粥樣硬化模型制作成功[3]。

有研究證明,血管損傷后2周內,平滑肌細胞的增生和凋亡處于相對平衡狀態[4];2周后細胞凋亡基本停止,而增生繼續,造成內膜增厚,管腔狹窄。AT RA治療組細胞在4周仍有凋亡發生,使血管損傷后平滑肌細胞的增殖和凋亡處于一種相對平衡狀態,從而抑制狹窄。ATRA作為一種具有廣泛生物學效應的維生素A類衍生物,可明顯抑制細胞增殖[5]。

細胞凋亡在動脈粥樣硬化早期可減少細胞成分在內膜積蓄而防止內膜增厚,進展期則能清除斑塊的炎癥細胞并減少泡沫細胞形成,促進動脈粥樣硬化的消退。p53是一種腫瘤抑制蛋白,具有促凋亡的作用,但在動脈粥樣硬化中的作用一直有爭論。有研究發現,血漿p53水平和頸動脈內膜厚度有關,冠心病患者冠脈粥樣硬化斑塊細胞中有p53的過度表達[6-7]。Sanz-González等發現,提高p53功能對機械損傷的內膜增生有抑制作用[8]。但p53誘導凋亡過程也可能帶來纖維細胞減少,甚至促進斑塊破裂[9]。單純高脂飲食兔頸動脈內膜下基本沒有p53陽性表達,而在空氣損傷后的內膜下則出現了較高的陽性表達,說明單純高脂血癥引起的動脈粥樣硬化斑塊內細胞凋亡并不明顯,而在內膜損傷后的斑塊中細胞凋亡明顯。實驗中,治

療組在第4周仍然有較高水平的p53表達,考慮ATRA誘導細胞凋亡可能是通過激活p53而實現的。針對血管損傷后細胞增殖過程中凋亡不足的干預治療,有望成為治療動脈粥樣硬化及再狹窄的方法。但是血管細胞過度凋亡是否會引起斑塊纖維帽變薄破裂,尚待進一步研究。

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