葛根素抑制脂多糖誘導RAW264.7巨噬細胞表達誘導型一氧化氮合酶

俞建,胡文志,季玲,孫烈

近年的研究表明,動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病[1]。巨噬細胞參與動脈粥樣硬化(AS)的形成、發展的全過程,而其表達的誘導型一氧化氮合酶(iNOS)與之密切相關[2]。研究發現,黃酮類藥物具有抗炎抗氧化應激的作用[3],葛根素(Puerarin,Pue)是目前臨床應用較多的黃酮類藥物,對其抗炎作用機制的相關研究較少[4]。本研究通過體外細胞培養,應用葛根素作用巨噬細胞,觀察葛根素對內毒素誘導巨噬細胞表達iNOS的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 RPMI 1640培養粉、TRIzol試劑盒:GIBCO公司;葛根素:SIGMA公司;各種半定量逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR)試劑和DNA marker:Takara生物公司,引物由上海博新生物公司合成。抗iNOS抗體、HRP標記的羊抗兔IgG抗體:Santa Cruz公司。

1.2 主要儀器 BCM-1000型超凈工作臺:中國蘇州;BB16型CO2培養箱:Heracus公司;CK40倒置相差顯微鏡:Olympus公司;GL-20B型低溫離心機:上海安亭科學儀器廠;PC2400擴增儀:Perkin Elmer公司;各種電泳儀、UVP凝膠圖像掃描系統等。

1.3 細胞培養 小鼠巨噬細胞株RAW264.7,購自中國科學院上海細胞研究所。用RPMI 1640完全培養液(10%胎牛血清,100 U/ml青霉素及 100 μ g/ml鏈霉素)在37℃、5%CO2培養箱中傳代培養3代,取對數生長期細胞用于實驗。

1.4 iNOS蛋白的測定 取對數生長期細胞,調整細胞密度為5×106/ml,接種于6孔板,2 ml/孔。18～20 h換含0.5%胎牛血清的RPMI 1640培養液,繼續培養20～24 h使細胞同步化后,預先2 h加入10、20、40 μ mol/L 葛根素,再用1 μ g/ml LPS刺激細胞18 h。用冰冷的PBS洗滌細胞2次,棄上清液。采用非變性裂解緩沖液提取細胞總蛋白,測定蛋白濃度后,分裝于-80 ℃保存待用。取蛋白樣品40 μ g,加入5×SDS蛋白上樣緩沖液,煮沸5 min后,以10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離;分離的蛋白用濕轉法轉移到PVDF膜,含5%脫脂奶粉 TBST 4℃封閉過夜;加入 1∶1000稀釋的一抗(兔抗iNOS),室溫震蕩孵育 2 h,TBST洗滌3次,每次10 min,加入相應二抗(HRP標記的羊抗兔 IgG,1∶10000),室溫震蕩孵育 1 h,TBST洗滌4次,每次10 min。化學發光法顯色拍照。以β-tubulin作為內參。

1.5 iNOS mRNA的測定 預先2 h加入同上濃度的葛根素,1 μ g/ml LPS刺激7 h。用冰冷的PBS洗滌細胞2次,棄上清液。按TRIzol試劑說明進行細胞總mRNA提取。細胞總mRNA溶于無Rnase水中,采用紫外分光光度計測定其濃度。引物序列為:上游引物 :5′-CCC TTC CGA AGT TTC TGG CAG C-3′,下游引物:5′-GGC TGT CAG AGC CTC GTG GCT T-3′;GAPDH 作為內參 ,上游引物 :5′-TGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG GC-3′,下 游引物:5′-CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CA C-3′。根據一步法RT-PCR試劑盒提供的說明書進行RT-PCR反應。RT-PCR反應產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色。電泳條帶用數字成像系統進行分析和拍照。以GAPDH光密度值進行標準校正,計算iNOS產物的相對量。

1.6 統計學方法 所有實驗結果重復3次,取平均值。計量資料結果用(±s)表示,多組間差異比較用單因素方差分析,顯著性水平α=0.01。

2 結果

2.1 iNOS蛋白質表達 隨著葛根素濃度的增加,iNOS蛋白質表達逐漸減少。見圖1。

圖 1 各組 RAW264.7細胞 iNOS蛋白質表達

2.2 iNOS mRNA表達 隨著葛根素的濃度的增加,iNOS mRNA表達逐漸減少。見圖2。

圖2 各組RAW264.7細胞 iNOS mRNA表達

3 討論

一氧化氮(NO)是由NOS催化左旋精氨酸(LArg)生成瓜氨酸的同時釋放出來的。NOS主要有兩種類型:結構型(cNOS)和誘導型(iNOS)。iNOS主要存在于巨噬細胞內,當內皮細胞受損時也可分泌。現有研究資料顯示,在人和動物的AS斑塊中,iNOS主要在巨噬細胞和平滑肌細胞中表達,iNOS產生的大量一氧化氮與過氧化物結合生成氧化性很強的過氧亞硝酸鹽化合物,后者能使低密度脂蛋白發生氧化,或其產生的活性自由基產物引起酪氨酸硝基化或其他修飾,阻斷磷酸化和脫磷酸化,干擾細胞正常的信號通路[5]。還有研究顯示,iNOS在AS斑塊深部表達,是血管壁損害及細胞變性、壞死的誘因之一[6-7]。

實驗研究表明,黃酮類化合物能有效抑制巨噬細胞中iNOS的表達[8]。葛根素是野生植物葛根中異黃酮的主要有效成分之一,其化學名為4'7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮,一些基礎研究表明,葛根素具有多種生理和藥理活性,例如降低膽固醇[9]、抗氧化應激[10]、抗腫瘤[11]、改善胰島素抵抗等[11]。其能否調節巨噬細胞表達iNOS無相關研究和報道。

我們發現,葛根素對 LPS誘導巨噬細胞 iNOS mRNA及其蛋白質表達抑制作用呈濃度依賴性,隨著葛根素濃度的增加,iNOS mRNA及其蛋白質表達逐漸減少,基因表達和蛋白質表達相一致。因此我們推測,葛根素能作用于巨噬細胞,通過下調iNOS mRNA的表達,減少巨噬細胞表達iNOS蛋白質,從而達到抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用。

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