牛血清白蛋白對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的增敏作用

萬明怡，周夢云，龍玉梅，嚴吉林，屠一鋒

（蘇州大學(xué) 材料與化學(xué)化工學(xué)部，江蘇 蘇州 215123）

電化學(xué)發(fā)光(ECL)分析是基于電化學(xué)反應(yīng)引發(fā)的化學(xué)發(fā)光而建立起來的一種分析方法［1-3］，常用的發(fā)光試劑有魯米諾、聯(lián)吡啶釕等，電化學(xué)氧化可使這些發(fā)光試劑氧化激發(fā)而發(fā)光，也可以通過氧化其它物質(zhì)再與發(fā)光試劑發(fā)生化學(xué)氧化反應(yīng)而發(fā)光，因此電化學(xué)發(fā)光可以有不同的發(fā)光歷程，形成多種方式的分析機理.相對于較為經(jīng)典的化學(xué)發(fā)光分析法，電化學(xué)發(fā)光分析有較為顯著的優(yōu)勢，化學(xué)發(fā)光分析通過試劑混合發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光，因而發(fā)光過程可控性較差，一般主要通過對反應(yīng)試劑流路的控制來實現(xiàn)對發(fā)光信號的可重復(fù)的測量，但這種流路控制技術(shù)需要有較高的自動化程度和精度，需要較為復(fù)雜和較高成本的儀器設(shè)備，而電化學(xué)發(fā)光分析由于是以電化學(xué)氧化作為發(fā)光的能量源，因此發(fā)光過程可控性好，通過施加電壓的方式來調(diào)節(jié)發(fā)光過程，可以實現(xiàn)在時間和空間上對發(fā)光過程的控制，測量易于實施，使用普通形式的電化學(xué)池即可實現(xiàn)分析目的，其靈敏度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性等性能都十分優(yōu)越，目前研究工作比較豐富，也已經(jīng)有一定范圍的應(yīng)用，作為一種高靈敏的分析檢測技術(shù)也越來越多地應(yīng)用于生物體系.由于以魯米諾為發(fā)光試劑的發(fā)光體系在中性介質(zhì)中的ECL較弱，因此尋找更多可靠而實用的增敏劑很有研究意義.已有文獻報道增敏劑如溶解氧［4］、H2O2［5］、氨基酸［6］及I-［7］等能增強其發(fā)光，并應(yīng)用于一些生物活性分子的檢測［8］.本文將報道牛血清白蛋白(BSA)對魯米諾ECL的增敏作用，實驗發(fā)現(xiàn)，在pH8.0的緩沖溶液中，牛血清白蛋白對魯米諾的電化學(xué)發(fā)光有較明顯的增敏作用，本研究為探索一種新方法用于測定蛋白質(zhì)提供了可能，也將擴大電化學(xué)發(fā)光分析的研究和應(yīng)用范圍.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑及儀器

魯米諾購自Fluka，牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma.實驗用水均為二次亞沸水，其它試劑均為分析純.

儀器裝置見參考文獻［9］，以數(shù)字脈沖發(fā)生器為信號源，經(jīng)恒電位儀施加于三電極系統(tǒng)，以Pt電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt絲為對電極.微弱光測量儀采用光電倍增管測量電化學(xué)發(fā)光信號，負高壓為800V，光電流經(jīng)放大轉(zhuǎn)換后由數(shù)字化接口傳入計算機進行記錄.

電極預(yù)處理：Pt電極經(jīng)拋光劑拋光、亞沸水清洗即可.

1.2 實驗條件及方法

脈沖幅值1.15V,上限電位0.85V，下限電位-0.3V；脈沖周期2s.

在電化學(xué)發(fā)光池中加入1mL待測溶液，用微量進樣器注入20μL 10-4mol/L魯米諾溶液，將電極系統(tǒng)置入其中并施加電壓，用微弱光測量儀檢測光強.

1.3 研究內(nèi)容

1.3.1 pH值及牛血清白蛋白濃度對魯米諾電化學(xué)發(fā)光強度的影響

文獻表明蛋白質(zhì)在pH=7.4左右時活性最大，pH過大或過小都容易使蛋白質(zhì)失活.而魯米諾的電化學(xué)發(fā)光以在較強的堿性溶液中發(fā)光強度較大，因此測定牛血清白蛋白需要選擇一個合適的化學(xué)環(huán)境，既要使蛋白質(zhì)保持活性，又要使魯米諾有足夠的發(fā)光強度，在pH6.0-10.0的緩沖溶液中測試相同濃度BSA的增敏效益，選取最佳條件.在所選定的最佳pH條件下，測定加入不同濃度BSA時魯米諾ECL強度與BSA濃度之間的關(guān)系，考察BSA對魯米諾ECL的增敏性能.

1.3.2 循環(huán)伏安法研究BSA對魯米諾氧化還原的影響

在電化學(xué)池中加入1mL含魯米諾的磷酸緩沖溶液，用微量注射器加入BSA，將電極置入其中并施加電壓，掃描循環(huán)伏安曲線，并討論兩者之間的相互作用.

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA測定條件的選擇

由于溶液酸堿度一方面影響魯米諾的ECL強度，同時又影響B(tài)SA的活性，因此是本研究中最主要考察的影響因素.較高的pH值條件下魯米諾具有較強的ECL，產(chǎn)生很大的測量背景，同時也可能造成BSA的變性而失去其原有的功能；過低的pH值條件下，魯米諾所產(chǎn)生的ECL信號很弱，同樣對測定不利.研究中在pH6.0-10.0范圍內(nèi)，檢測不同pH緩沖溶液中BSA對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的增敏作用，結(jié)果表明在pH=8.0時BSA對魯米諾電化學(xué)發(fā)光信號增敏效果最佳，如圖1所示.因此將此pH值的磷酸鹽緩沖溶液作為研究中使用的支持電解質(zhì)溶液.

2.2 BSA濃度與發(fā)光強度的關(guān)系

在pH=8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，不同濃度BSA對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的影響見圖2.隨著BSA濃度的增加，ECL信號增強，在BSA濃度達到1.2×10-8g/mL時，ECL達到信號最強.隨后濃度增加信號減弱，這可能是由于BSA為生物大分子，濃度過高時可能會發(fā)生散射，導(dǎo)致ECL強度降低.

2.3 BSA對魯米諾氧化還原行為的影響

圖2 不同濃度BSA對魯米諾電化學(xué)發(fā)光的影響c(Luminol)=2.0×10-6mol/L

圖4 BSA濃度對魯米諾氧化還原峰電流的影響c(Luminol)=2×10-4mol/L

采用循環(huán)伏安法研究BSA存在時魯米諾的氧化還原行為有助于理解BSA增敏魯米諾ECL的原因，當(dāng)在魯米諾溶液中加入較低濃度BSA時，可以明顯觀察到魯米諾的氧化還原電流增大，其循環(huán)伏安曲線見圖3，但峰電位及形狀未發(fā)生變化，表明其電化學(xué)行為未發(fā)生任何變化，只是氧化還原反應(yīng)發(fā)生的程度有所提高.但隨著BSA濃度的增加，魯米諾的氧化還原峰電流又趨于減小，圖4所示為魯米諾氧化還原峰電流隨BSA濃度的變化.

由圖3、4可以看出，魯米諾的氧化還原峰電流隨著BSA濃度的增加而增加，但當(dāng)加入BSA的濃度過大時，氧化還原峰電流又會逐漸減小.上述實驗盡管在測定中由于靈敏度等因素而選擇使用不同的魯米諾濃度，因此BSA對魯米諾的ECL或CV行為產(chǎn)生影響的濃度上略有差異，但表現(xiàn)出的規(guī)律是一致的，即低濃度BSA的加入無論對魯米諾的電化學(xué)氧化還原還是電化學(xué)發(fā)光都具有明顯的促進作用，而當(dāng)BSA濃度較大時，這種促進作用逐步減弱.

在上述條件下，在BSA濃度為1.00×10-9～1.20×10-8g/mL的范圍內(nèi)，魯米諾的電化學(xué)發(fā)光強度和BSA的濃度成線性關(guān)系，線性方程為I=0.87+0.37CBSA，r=0.9941，這為利用魯米諾的ECL測定蛋白質(zhì)提供了一種靈敏的新方法.

3 機理討論及結(jié)論

由上述實驗結(jié)果可知，在pH8.0的磷酸緩沖溶液中，BSA對魯米諾的電化學(xué)氧化還原過程表現(xiàn)出了一定程度的促進作用，但這種促進作用并不改變魯米諾的氧化還原機理，因此可以推測為當(dāng)在魯米諾溶液中加入一定濃度BSA時，魯米諾分子被吸附于BSA表面，同時由于BSA在電極上有一定的吸附性，從而使電極表面對魯米諾發(fā)生一定程度的富集，使魯米諾的電化學(xué)氧化還原得以增強，同時，由于魯米諾的ECL過程是基于魯米諾的氧化激發(fā)，因此電極表面有更多魯米諾發(fā)生氧化時，其激發(fā)態(tài)的數(shù)量也相應(yīng)增加，從而導(dǎo)致ECL強度的增強.而當(dāng)BSA濃度進一步增加時，BSA分子間可能發(fā)生聚合，則上述由于吸附引起的對魯米諾的氧化還原的促進作用減弱，同時由于BSA聚合體體積增大、數(shù)量增加，溶液的散射程度也會增加，導(dǎo)致所檢測到的ECL強度逐步減小.該研究為測定蛋白質(zhì)提供了一個新方法，同時也擴大了電化學(xué)發(fā)光分析的應(yīng)用范圍.

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