人參皂苷Rb3在Caco-2單細胞層模型上的吸收特征研究Δ

趙潔，楊彩華，胡明，劉中秋（南方醫科大學藥學院藥劑系，廣州市510515）

人參皂苷Rb3為五加科人參屬植物的主要活性成分之一，在缺血時可通過抑制神經元持續性鈉電流的增加幅度發揮對缺血性神經元的保護作用[1]，具有良好的抗腦缺血、抗血栓以及保護神經細胞作用[2]。對于人參皂苷Rb3含量的測定，目前多采用高效液相色譜－紫外分光光度（HPLC－UV）及高效液相色譜－蒸發光散射（HPLC－ELSD）檢測法[3]。但這些方法受靈敏度及線性范圍的限制，很難準確定量藥物濃度較低的細胞樣品。筆者建立了檢測細胞樣品中人參皂苷Rb3的液相色譜串聯質譜電噴霧（LC－MS/MS）法，并研究了人參皂苷Rb3在Caco－2單細胞層模型上的吸收特征，這在國內尚未見文獻報道。

1 材料

1.1 儀器

6410型液-質聯用串聯四極桿質譜儀（美國Agilent公司），包括Agilent 1200型高分離快速液相色譜、ESI電噴霧離子源、三重四極桿質量分析器；Gradient A10型超純水系統、Millicell－ERS型跨膜電阻儀（美國Millipore公司）；Forma SeriesⅡ型CO2培養箱（美國Thermo electron公司）；TS100－F型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；Eppendorf 5810R型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；MS 3D型渦旋混勻器（德國IKA公司）；插入式細胞培養儀（丹麥Nunc公司）。

1.2 試藥

DMEM高糖培養基、胰蛋白（EDTA，美國Gibco公司）；胎牛血清非必需氨基酸（NEAA，美國Hyclone公司）；谷氨酰胺、青-鏈霉素雙抗溶液、Hank’s液（HBSS，美國Sigma公司）；鼠尾膠原（美國BD公司）；人參皂苷Rb3、人參皂苷Rg2（吉林大學化學學院，純度均≥98%）；乙腈、甲酸銨均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 細胞株

細胞Caco－2 TC7細胞株，由美國休斯敦大學胡明教授饋贈。

2 方法與結果

2.1 細胞培養

將Caco－2細胞接種于T75的細胞培養瓶中，培養條件為DMEM高糖培養基，添加1%NEAA、1%谷氨酰胺、10%胎牛血清、1%青－鏈霉素雙抗溶液，通入5%CO2（相對濕度90%），置于37℃培養箱中培養，按每1 mL 2×105個接種于預先以鼠尾膠原（4.36 mg·mL－1）涂布的含有聚碳酸酯膜的內襯皿上。種板后第2天換液，之后隔天換液，19～21 d后測其跨膜電阻，當電阻值＞420 ohm時，表明細胞分化完全并已形成致密的單細胞層，符合要求，可用于藥物轉運試驗。

2.2 藥物的跨膜轉運試驗

試驗前以37℃的Hank’s平衡鹽溶液（HBSS液，pH 7.4）輕輕蕩洗細胞單層3次，測其跨膜電阻，若符合試驗要求，則每孔加入2 mL 37℃HBSS液，置于空氣搖床上繼續孵育1 h，除去細胞表面的附著物，棄去HBSS液。藥物從絨毛面（AP）側至基底面（BL）側的轉運試驗操作為：于AP側加入人參皂苷Rb3的HBSS液（C010 μg·mL－1、pH7.4）2.5 mL，同時于BL側加入空白的HBSS液（pH7.4）2.5 mL。置于37℃轉速為50 r·min－1的空氣搖床上，分別于載藥后1、2、3、4 h于BL側采樣0.5 mL，并于采樣側補充等體積空白HBSS液，試驗平行3份。藥物從BL側至AP側的轉運則將藥物加入BL側，AP側加入空白的HBSS液，其它步驟同AP側至BL側的轉運試驗操作。

2.3 細胞樣品處理

取上述細胞樣品30 μL，精密加入內標溶液（每1 mL人參皂苷Rg2含0.5 μg）10 μL，流動相加至100 μL，渦旋混合，4 ℃下，13 000 r·min－1離心30 min，取上清液20 μL進樣，以樣品與內標峰面積比進行定量分析。

2.4 LC-MS/MS分析

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent RR HT ZORBAX Eclipse XDS-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈-1 mmol·L-1甲酸銨水溶液（34∶66）；流速：0.4 mL·min－1；柱溫：30 ℃；進樣量：20μL。

2.4.2 質譜條件 采用電噴霧離子化方式（ESI），以多重離子反應（MRM）、負離子模式進行檢測。檢測條件：人參皂苷Rb3為m/z1077.7→m/z783.4，Fragmentor為 200 V，Collision Energy為58 V；內標人參皂苷Rg2為m/z783.6→m/z475.1，Fragmentor為270 V，Collision Energy為45 V；離子源參數：霧化氣溫度為350 ℃，氣流為11 mL·min－1，氣壓為40 psi，毛細管電壓為4 000 V。

2.5 方法學驗證

2.5.1 HBSS溶液中人參皂苷Rb3標準曲線的制備 取空白HBSS溶液30 μL，精密加入不同濃度的人參皂苷Rb3標準品溶液10 μL，使其終濃度分別為50、80、200、400、1 000、2 000 ng·mL－1，按“2.3”項下方法操作。以樣品濃度（C）為橫坐標，樣品與內標峰面積之比（R）為縱坐標，進行線性回歸。得回歸方程R＝2.865 7C-0.249 7（r＝0.9903）。結果表明，人參皂苷Rb3檢測濃度在50～2 000 ng·mL－1范圍內與樣品與內標峰面積之比呈良好線性關系。最低檢測限為20 ng·mL－1。

2.5.2 方法的專屬性 在本試驗條件下，細胞中的雜質不干擾人參皂苷Rb3、內標人參皂苷Rg2的檢測，基線噪聲小，人參皂苷Rb3與人參皂苷Rg2的保留時間分別為3.42、3.68 min。本法具有較好的專屬性。LC-MS/MS圖譜見圖1。

2.5.3 方法回收率試驗 取空白HBSS溶液30 μL，精密加入不同濃度的人參皂苷Rb3對照品溶液10 μL，使其終濃度分別為80、400、2 000 ng·mL－1，按“2.3”項下方法操作，測定HBSS溶液中人參皂苷Rb3的回收率，每個濃度重復5次。人參皂苷Rb3在HBSS溶液中的回收率試驗結果見表1。

圖1 LC-MS/MS圖A、B.空白HBSS溶液；C.空白HBSS溶液加入人參皂苷Rb3；D.空白HBSS溶液加入人參皂苷Rg2；E.孵育4 h的人參皂苷Rb3細胞樣品；F.孵育4 h的人參皂苷Rg2細胞樣品；E.Rb3標準品；F.Rg2標準品Fig 1 LC-MS/MS chromatogramsA，B.blank HBSS solution；C.blank HBSS solution spiked with ginsenoside Rb3；D.blank HBSS solution spiked with ginsenoside Rg2；E.cell sample after incubating with Ginsenoside Rb3for 4 hours；F.cell sample after incubating with Ginsenoside Rb2for 4 hours；E.standard ginsenoside Rb3；F.standard Ginsenoside Rg2

表1 人參皂苷Rb3在HBSS溶液中的回收率試驗結果（n＝5）Tab 1 Recovery of ginsenoside Rb3in HBSS solution（n＝5）

2.5.4 方法精密度（RSD）試驗 取空白HBSS溶液30 μL，精密加入不同濃度的人參皂苷Rb3對照品溶液10 μL，使其終濃度分別為80、400和2 000 ng·mL－1，按“2.3”項下方法操作，每天進行5樣本測定作為日內RSD，連續測定3 d，計算日間RSD，測定日內和日間變異情況。結果，人參皂苷Rb3在80、400、2 000 ng·mL－1水平下，日內和日間RSD均＜15%，符合生物樣本的測定要求。

2.6 人參皂苷Rb3的跨膜雙向轉運特征研究

以10 μmol·L-1的人參皂苷Rb3HBSS溶液通過Caco-2單細胞層模型，考察其從AP側至BL側及BL側至AP側的轉運量隨時間變化情況。藥物表觀滲透系數的大小反映了藥物透過單層細胞的能力以及藥物吸收的速度及程度。其值可由下式計算：Papp＝ΔQ/（Δt·A·C0）。式中，ΔQ為在Δt時間內藥物透過的量；A為單細胞層面積，本試驗中為4.2 cm2；C0為藥物初始濃度；Papp的單位以cm·s-1表示。結果，顯示，10 μmol·L-1的人參皂苷Rb3從AP側至BL側的Papp為3.22×10-6cm·s-1，BL側到AP側的Papp為6.0×10-6cm·s-1，PBL-AP/PAP-BL比值為1.86。人參皂苷Rb3滲透系數測定結果見表2。

表2 人參皂苷Rb3滲透系數測定結果（±s，n＝3）Tab 2 Apparent permeability coefficient（Papp）of ginsenoside Rb3across the Caco-2 cell monolaye（r±s，n＝3）

表2 人參皂苷Rb3滲透系數測定結果（±s，n＝3）Tab 2 Apparent permeability coefficient（Papp）of ginsenoside Rb3across the Caco-2 cell monolaye（r±s，n＝3）

濃度/μmol·L-1 10 Papp/×10-6（cm·s-1）AP-BL 3.22±1.68 BL-AP 6.0±4.71 PBL-AP/PAP-BL 1.86

3 討論

人參皂苷的檢測方法，文獻多以HPLC-UV以及HPLC-ELSD法為主，這些方法受靈敏度及線性范圍的限制，無法滿足細胞轉運研究定量的要求。因此，筆者建立LCMS/MS法測定人參皂苷Rb3，在流動相中添加1 mmol·L-1甲酸銨，能夠改善人參皂苷Rb3峰形、提高進樣的響應值和重現性。

關于人參皂苷Rb3的吸收機制研究國內尚未見文獻報道。本研究采用Caco-2單細胞層模型研究人參皂苷Rb3透過單細胞層的雙向轉運特征，結果顯示，人參皂苷Rb3從AP側至BL側以及BL側至AP側的轉運量均隨時間的增加呈線性升高。其雙向轉運Papp值均在10-6數量級，表明其經腸道吸收較差。PBL-AP/PAP-BL為1.86，外排大于吸收，提示人參皂苷Rb3的轉運可能存在外排轉運蛋白的參與。在腸道中存在P-糖蛋白（P-gp）、多藥抗藥性相關蛋白（MRPs）等外排轉運蛋白，這些轉運蛋白可以將進入BL側的藥物外排至AP側，使吸收減少[4]。為考察人參皂苷Rb3的轉運是否有外排轉運蛋白參與，本研究采用了高靈敏度的LC-MS/MS檢測方法，并選用較低濃度的人參皂苷 Rb3（10 μmol·L-1）為研究對象考察其在Caco-2單細胞層模型上的雙向轉運特征，避免了可能存在的外排蛋白被飽和現象的影響。結果表明，人參皂苷Rb3外排大于吸收，這是否由外排轉運蛋白引起，且哪種轉運蛋白參與人參皂苷Rb3的外排，有待繼續深入研究。

[1]江煒煒，姜正林，柯開富.人參皂苷Rb3對缺血及正常神經元持續性鈉電流的影響[J].藥學與臨床研究，2007，15（6）：444.

[2]楊志剛.中藥三七對神經系統和免疫系統的影響[J].中國藥房，2008，19（18）：1 424.

[3]朱 潔，楊 蓉，張洪彬.HPLC-ELSD法測定三七葉中人參皂苷Rb3、Rc、Rb1的含量[J].中草藥，2004，35（12）：1 365.

[4]Patel J，Buddha B，Dey S，et al.In virtro interaction of the Hiv protease inhibitor ritonavir with herbal constituents：changes in P-gp and CYP3A4 activity[J].Am J Ther，2004，11（4）：262.