鹽酸氟西汀微乳的制備及其離體大鼠透皮作用研究

蔡霞，呂竹芬，陳燕忠（廣東藥學(xué)院/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州市510006）

微乳是一種外觀透明、液滴粒徑小于100 nm、熱力學(xué)穩(wěn)定的體系[1，2]。微乳作為藥物載體，還具有低黏度、吸收迅速、靶向釋藥的特點，并可提高藥物的生物利用度，降低毒副作用[3]，因此，近年來微乳在經(jīng)皮給藥方面逐漸成為研究的熱點。

鹽酸氟西汀（Fluoxetine hydrochloride，F(xiàn)LU），化學(xué)名為（±）-N-甲基-γ-[4-（三氟甲基）-苯氧基]-苯丙胺鹽酸鹽。分子量為345.8，熔點為155～158℃，易溶于乙醇和氯仿，微溶于水，乙醚中不溶。FLU是親脂類藥物，易透過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是一種神經(jīng)中樞5-羥色胺特異性重攝取抑制劑，目前在臨床上是治療重度抑郁癥的首選藥物。但是FLU由于需要長期給藥，且有胃腸刺激副反應(yīng)，因此，患者依從性較差，易致維持治療失敗[4]。為克服此缺點，依據(jù)透皮給藥途徑對藥物的理化性質(zhì)要求[5]，可將其制成透皮給藥制劑，并具有使用舒適方便、劑量調(diào)整簡單的優(yōu)點。基于此，本實驗室制備了含F(xiàn)LU的O/W微乳，用改進的Franz擴散池對FLU微乳經(jīng)離體大鼠皮的透皮速率進行了研究，評價了FLU微乳的透皮作用。

1 材料

Ultimate3000高效液相色譜儀（戴安公司）；TK-12B透皮擴散試驗儀（上海凱鍇科技貿(mào)易有限公司）；Zetasize Nano-ZS90多功能電位/粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

FLU原料藥（上海華理生物醫(yī)藥有限公司，批號：810001，含量：99.54%）；FLU對照品（澳大利亞Alphapharm Pty Ltd Company，批號：B0590ME，含量：99.7%）；FLU微乳（自制，規(guī)格：9.95 mg·mL－1）。

肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、油酸乙酯（EO）、油酸（OA）均由國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供；聚乙二醇羥硬脂酸酯15（Solutol?SH15）、聚氧乙烯蓖麻油（Cremophor EL35）、聚氧乙烯氫化蓖麻油（Cremophor RH40）均由德國BASF Chemical Company提供；聚乙二醇400（PEG400，廣東汕頭市西隴化工廠）；三辛酸/癸酸甘油酯（GTCC，英國禾大公司）；四氫呋喃、甲醇均為色譜純，其余試劑均為分析純。

Wistar大鼠，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，♂，體質(zhì)量（220±20）g。許可證號：SCXK（粵）2008-0020，粵監(jiān)證字2008A003。

2 方法與結(jié)果

2.1 空白微乳處方組成的篩選

以Solutol?SH15、Cremophor RH40、Cremophor EL35、吐溫-80為表面活性劑，甘油、丙二醇、PEG400為助表面活性劑，EO、OA、GTTC、IPM為油相，根據(jù)三者不同的質(zhì)量配比，利用偽三元相圖初步篩選出表面活性劑、助表面活性劑、油相和表面活性劑/助表面活性劑的質(zhì)量比（Km值）。質(zhì)量配比見表1。

表1 表面活性劑/助表面活性劑與油相質(zhì)量配比Tab 1 The mass ratio of surfactant/cosurfactant to oil phase

分別將表面活性劑與助表面活性劑混勻后，室溫下攪拌10 min，再依次與油相按不同質(zhì)量比均勻混合，用蒸餾水滴定3種成分的混合物，觀察是否形成澄清透明的微乳，并繪制偽三元相圖。通過偽三元相圖確篩選出空白微乳處方的組成為IPM/Solutol?SH15/PEG400/水，Km為1∶1。

2.2 FLU微乳的制備

在室溫下將IPM、Solutol?SH15、PEG400按比例充分混合后，加入FLU原料藥，充分?jǐn)嚢瑁怪芙猓缓笤跀嚢璧臈l件下緩慢滴入處方量的水，即得透明的FLU微乳樣品。

2.3 微乳類型的鑒定

染色法：亞甲藍染料為水溶性溶液，易在水溶液中擴散：蘇丹紅染料為油性染料，易在油相中擴散。如果亞甲藍染料的擴散速度大于蘇丹紅染料的擴散速度，則為O/W型微乳；相反則為W/O型微乳。

取相同體積的空白微乳和FLU微乳，同時分別加入亞甲藍染料和蘇丹紅，靜止放置，結(jié)果，空白微乳和FLU微乳中水溶性亞甲藍染料的擴散速度大于油溶性的蘇丹紅染料的擴散速度，故確證制備的空白微乳和FLU微乳為O/W型微乳。

2.4 微乳的粒徑及分布

用粒度分析儀測得微乳的平均粒徑為44.6 nm，呈正態(tài)分布，多分散系數(shù)為0.317，詳見圖1。

圖1 微乳粒度正態(tài)分布圖Fig 1 Normal distribution of particle diameter

2.5 微乳的離心試驗

通過離心試驗評價微乳的物理穩(wěn)定性。取適量FLU微乳置于離心試管中，以10 000 r·min－1的速度離心15 min，觀察微乳的外觀和沉降情況。結(jié)果表明，微乳澄清透明，不分層，不沉降，符合微乳穩(wěn)定性的要求。

2.6 含量測定方法的建立

2.6.1 色譜條件。色譜柱：Kromasil 100-5 C8（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相：1.0%三乙胺（用磷酸調(diào)pH值為6.0）-四氫呋喃-甲醇（40∶40∶20）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：227 nm；進樣體積：20 μL。在此色譜條件下，取“2.6.2”項下對照品溶液及“2.8”項下空白皮膚接收液、供試品接收液進樣分析，結(jié)果，輔料及皮膚內(nèi)源性物質(zhì)不干擾FLU的測定，色譜詳見圖2。

2.6.2 線性關(guān)系。精密稱取FLU對照品10 mg，置于100 mL容量瓶中，以甲醇溶解，得濃度為100μg·mL－1的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液，用甲醇稀釋成濃度為10、25、50、75、100 μg·mL－1的對照品溶液，精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，以峰面積（A）對濃度（C）作線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝0.704 9C－0.844 8（r＝0.999 7），表明FLU檢測濃度線性范圍為10～100 μg·mL－1。

2.6.3 回收率試驗。制備低、中、高3個濃度（相當(dāng)于200、250、300μg·mL－1）的對照品溶液，精密移取上述溶液與空白微乳各1 mL，分別置于5 mL容量瓶中，加適量甲醇溶液超聲20 min，定容，過濾，精密吸取20μL，注入液相色譜儀，記錄結(jié)果分別計算。結(jié)果，低、中、高濃度的樣品回收率分別為100.6%、106%、102.8%，RSD分別為1.89%、1.02%、1.73%。

2.6.4 精密度試驗。取濃度為40、50、60 μg·mL－1的FLU對照品溶液，分別于與同日內(nèi)重復(fù)進樣6次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)6 d重復(fù)進樣6次，考察日間精密度。結(jié)果表明，低、中、高3個濃度的日內(nèi)、日間RSD均小于2%，表明精密度符合方法學(xué)要求。

圖2 高效液相色譜圖1.空白皮膚接收液；2.對照品；3.供試品接收液；a.溶劑；b.FLUFig 2 HPLC chromatograms1.blank skin receiving solution；2.reference substance；3.test receiving solution；a.solvent；b.fluxetine hydrochloride

2.7 微乳初步穩(wěn)定性考察

將FLU微乳密封后在室溫條件下（相對濕度為75%）放置，于0、2、4個月取樣觀察，測定各項指標(biāo)。結(jié)果，微乳在室溫條件下放置外觀澄清透明，無沉淀析出，離心后也未見分層，含量分別為100%、99.7%、99.5%，無明顯降低。

2.8 透皮試驗

2.8.1 離體鼠皮的制備。將大鼠處死，用脫毛劑脫毛，剝離腹部皮膚，在玻璃板上小心刮去皮下脂肪和粘連物，用蒸餾水和生理鹽水沖洗干凈，冷凍保存，待用。

2.8.2 透皮方法。將大鼠腹部皮膚固定在Franz擴散池的2個半池之間，角質(zhì)層面向供給池，有效滲透面積2.92 cm2，接受液體積為7 mL，溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為250 r·min－1。接收液為0.02%疊氮化鈉生理鹽水。取1 mL FLU（9.95 mg·mL－1）微乳適量均勻涂布于皮膚表面，分別于1、2、4、6、8、10、12 h取樣1 mL（同時補充等量同溫接收液），樣品適量稀釋，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進樣測定，計算單位面積累積透皮量（Q）和穩(wěn)態(tài)透皮速率（J）。

用公式Qn＝CnV/A計算藥物累積透皮量，其中Qn為t時間單位面積累積透皮量，Cn為t時間藥物的濃度，V為接受液總體積，A為有效擴散面積，以Qn對t采用Higuchi方程擬合，所得直線斜率即為平均透皮速率Jss（μg·cm－2·h－1）。

2.8.3 油相含量對FLU透皮吸收的影響。以IPM占體系質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4%、7%、11%、20%、25%制備FLU微乳液，進行體外透皮試驗，考察不同油相含量對FLU透皮吸收的影響，繪制Q-t曲線，結(jié)果詳見圖3。

圖3 油相含量對FLU透皮吸收的影響Fig 3 Effect of the content of oil phase on the percutanous penetration of FLU

從圖3可見，在藥物濃度相同情況下，當(dāng)體系中IPM含量為4%時，12 h內(nèi)無藥物透過（故在圖3中無此曲線）；當(dāng)IPM含量由7%增大到11%時，J值和Q值驟然增加；當(dāng)IPM含量為11%時J和Q值均達到最大值，隨后二者均隨含量增大而降低。可見IPM雖然是一種有效的透皮吸收促進劑，其促進效果并不隨含量增大而線性增加，存在最佳濃度值，當(dāng)其濃度超過該值時，透皮吸收促進效果反而下降。

2.8.4 混合表面活性劑含量對FLU透皮吸收的影響。當(dāng)油相的量固定為11%，混合表面活性劑的總量（Smix，即表面活性劑Solutol?SH15和助表面活性劑PEG400質(zhì)量之和）分別為35%、43%、48%、52%、55%時，考察不同Smix對FLU透皮吸收的影響，繪制Q-t曲線，結(jié)果詳見圖4。

圖4 混合表面活性劑含量對FLU透皮吸收的影響Fig 4 Effect of the content of mixed surfactants on the percutanous penetration of FLU

由圖4可見，隨著Smix的增加，藥物的J值先增大后減小；當(dāng)Smix為43%時，J和Q值均達到最大值。這可能是因為連續(xù)相中藥物的濃度決定藥物透皮吸收，表面活性劑的濃度過高會使連續(xù)相中分子存在的藥物濃度降低，導(dǎo)致藥物的擴散速度下降，從而使藥物在皮膚的滯留量下降[6]。

2.8.5 載藥量對FLU透皮吸收的影響。制備含F(xiàn)LU分別為0.5%、0.7%、1%、2%、4%（W/W）的微乳液，按“2.8.2”項下方法進行離體大鼠皮膚體外透皮試驗。考察不同載藥量對FLU透皮吸收的影響，繪制Q-t曲線，結(jié)果詳見圖5。

圖5所示，微乳的載藥量由0.5%增加到1%時，J值明顯增加（P＜0.05）；而當(dāng)載藥量增加至2%時，J值則下降。這表明皮膚的吸收過程存在“飽和”現(xiàn)象，隨著體系載藥量的增加，藥物與載體的親和力可能亦相應(yīng)增加，從而使藥物的熱力學(xué)活性降低，J值下降。

對以上結(jié)果綜合分析，得到微乳經(jīng)皮滲透的處方為FLU/IPM/Solutol?SH15/PEG400/水（1∶9∶20∶20∶39）。

圖5 載藥量對FLU透皮吸收的影響Fig 5 Effect of drug-loading amount on the percutanous penetration of FLU

2.8.6 處方驗證試驗。根據(jù)以上結(jié)果，即以油相含量為11%、混合表面活性劑含量為43%、載藥量為1%，制備3批FLU微乳。以Q對t采用Higuchi方程擬合，得3批樣品的平均J值為（128.96±0.32）μg·cm－2·h－1，詳見表2。

表2 3批FLU微乳的透皮試驗結(jié)果Tab 2 Permeation parameters of 3 batches of FLU microemulsion

3 討論

油相、表面活性劑及助表面活性劑是形成微乳所必需的組分，但由于種類繁多，本文利用偽三元相圖進行處方篩選，得到空白微乳的處方組成為IPM/Solutol?SH15/PEG400/水。

微乳透皮性能高低與油相的種類、含量直接相關(guān)，研究表明IPM既可作為微乳的油相，又可以增加角質(zhì)間的脂質(zhì)流動性，使藥物更易透過角質(zhì)層，具有強大的促透效果[7]；表面活性劑可能是通過改變角質(zhì)層、膽甾醇和類脂的結(jié)構(gòu)甚至移除從而起到促進透皮吸收的作用；助表面活性劑可插入到表面活性劑的界面膜中，形成復(fù)合凝聚膜，提高膜的牢固性和柔順性，又可大大增加表面活性劑的溶解度，同時形成更小的乳滴，并增加納米乳的透皮性；微乳中藥物的溶解量也會影響載藥系統(tǒng)的透皮吸收能力。

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