新型免疫介導骨髓造血功能衰竭小鼠模型的建立及特性分析

孫 諭 顧 軍 張 宏 張曉慧 張學光 傅晉翔 (蘇州大學附屬第二醫院血液科,蘇州215004)

再生障礙性貧血(AA)主要表現為骨髓造血功能低下、全血細胞減少,其發病機制尚未闡明,眾多研究表明免疫異常在AA發生、發展中起主要作用[1]。已往的再障的動物模型,通過應用環磷酰胺等細胞毒藥物及放射致骨髓造血損傷是主要手段。現有研究表明[2],體內存在一組具有調節作用的T細胞(T-regs),在體內和體外抑制T細胞反應。在一些自身免疫性疾病及相關的動物模型中,人們在CD4+和CD8+T細胞中均發現該亞群的存在,CD4+Treg細胞誘導免疫抑制作用的發生,而CD8+T-regs不僅是細胞毒性效應T細胞,且具有免疫抑制作用,從而預防自身免疫應答的發生[2]。目前認為T-regs介導的免疫抑制作用是一種重要的主動機制,通過與其它免疫細胞直接接觸或分泌抑制性的細胞因子如IL-10及TGF-β發揮作用,維持自身免疫耐受。去除T-regs或T-regs細胞功能異常,均可導致自身免疫性疾病的發生[3]。近年來越來越多的學者認識到免疫機制紊亂尤其是細胞免疫功能紊亂在再障發病中的作用,本文旨在通過體外誘導建立再生障礙性貧血動物模型,了解調節性T細胞的變化,從而探討T-regs在再障免疫發病機制中可能發揮的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備 參照Bloom的實驗方法[4],B6(C57BL/6)和BALB/cBy小鼠均購自中國科學院上海實驗動物中心,將6～16周齡B6(C57BL/6)雄性鼠和BALB/cBy雌性鼠按雌雄配對分籠飼養,培育產生cBy/B6F1。取6～12周cBy/B6F1做受體,將雄性B6作為供體,取雄性B6的腹股溝、腋下、側腋下淋巴結,用PBS打勻并碾壓制成淋巴細胞勻漿,用100μm的鉬網過濾后,1 000 r/min離心5～10分鐘,然后棄上清,用PBS重懸,制成淋巴細胞懸液,用血細胞計數板進行計數,調整細胞數在10×106～40×106L-1。將制成的細胞懸液從cBy/B6F1的尾靜脈中注入,將cBy/B6F1按注入的淋巴細胞數量分成四組,每組小鼠為5～7只(見表1)。注射淋巴細胞懸液后的cBy/B6F1被特殊照顧,食物和水經過輻照。

1.2 外周血的采集、骨髓涂片、骨髓病理活檢 在注射B6淋巴細胞懸液的cBy/B6F1后,分別在第3、5、9、14天從尾靜脈采集外周血,用SYSMEX-2100血細胞分類儀進行外周血細胞計數,并分別于回輸父系淋巴細胞懸液后第 5、9、14天,各取 cBy/B6F1一只進行斷頸處死,取一側股骨,然后用少量生理鹽水沖洗,制成骨髓涂片,經Gimsa染色后,顯微鏡(OLYMPUSBX500)下觀察。當出現外周血細胞計數明顯下降,表現為全血細胞減少,Hb＜60 g/L,WBC＜2.0×109L-1,Plt＜20×109L-1時,斷頸處死,取一側股骨,進行骨髓涂片,取另一側股骨,浸泡在10%的福爾馬林溶液中,然后脫鈣,進行骨髓病理活檢。

1.3 流式細胞儀分析 分別于回輸父系淋巴細胞懸液后第5、9、14天,外周血象呈進行性下降,各取cBy/B6F1一只進行摘眼球放血,采血約400μl,用紅細胞裂解液進行溶血后,每管放30～50μl,然后加10μl抗體,進行雙標檢測。選用鼠單克隆抗體CD3-PE 、CD4-FITC 、CD8-FITC 、CD25-PE 、CD28-PE 、CD103-PE 、CD152-PE、CD62L-PE、GITR-PE 標記 ,室溫孵育30分鐘,用PBS洗兩次,FCM測定,陰性對照為同型IgG。采用直接免疫熒光標記,流式細胞術(FCM,Beckman-Coulter產品)分析法。

1.4 統計學處理 應用SAS8.0統計軟件。數據經檢驗為偏態分布資料,所有測定值均以M+QR表示。兩變量間比較采用Wilcoxon秩和檢驗,以P＜0.05為差異有統計意義。

2 結果

2.1 輸注淋巴細胞數決定受體小鼠骨髓造血功能衰竭的程度 實驗證實,受體鼠血細胞下降的程度與注入的淋巴細胞數量成正相關;血細胞下降與注入時間相關。當注入細胞數為 10×106/只時,約20%的F1小鼠出現了全血細胞減少,但無死亡;細胞數在11×106～21×106/只時,約40%的小鼠出現全血細胞減少,其中一只在第21天出現死亡;細胞數達21×106～30×106/只時,受體小鼠均有全血細胞減少,其中6只在注入后14～21天死亡;細胞數為31×106～40×106/只時,所有受體小鼠在輸注后2周時死亡,(詳見表1)。在注射B6淋巴細胞懸液的 cBy/B6F1 后,分別在第 3、5、9、14 天從尾靜脈采集外周血,第3天外周血象無明顯變化,可出現淋巴細胞比例的升高;第5天血象有所下降,Hb在80 g/L左右,WBC＜3.5×109/L,淋巴細胞比例升高,Plt＜80×109L-1;第9天,血象明顯下降,Hb在60～70g/L,WBC＜2.0×109L-1,淋巴細胞比例達70%以上;Plt＜30×109L-1;至第14天,表現為全血細胞減少,Hb＜60 g/L,WBC＜2.0×109L-1,Plt＜20×109L-1,淋巴細胞比例占90%以上,出現粒細胞的缺少;詳見表2。

2.2 輸入淋巴細胞觸 發受體鼠產生免疫介導的骨髓造血功能抑制:取下死亡小鼠的一側股骨,用生理鹽水,5號針尖將骨髓沖出,制成骨髓細胞涂片,經Gimsa染色顯微鏡下觀察,骨髓象呈現骨髓有核細胞增生低下,粒細胞比例明顯下降,淋巴細胞比例上升,巨核細胞減少或缺如(圖1、2),取另一側股骨,浸泡在10%的福爾馬林溶液中,然后脫鈣,進行骨髓病理活檢。發現骨髓病理活檢片中骨髓增生減低,主要為脂肪細胞、淋巴細胞,并可見巨核細胞顯著減少,見圖 3、4。

2.3 通過外周血象、骨髓涂片、骨髓活檢證實為再生障礙性貧血,進行流式細胞儀測調節性T細胞的表達,發現與正常cBy/B6F1存在明顯差異(表2)。并且在我們的實驗中發現,隨著注入父系淋巴細胞時間的增加,血象進行性下降,CD4+CD25+、CD8+CD25+、CD8+CD28-較正常cBy/B6F1相比呈下降趨勢,見表3。

表1 輸入淋巴細胞數與受體小鼠外周血象變化的關系Tab.1 The relationship between the infusion of the number of lymphocytes and thechanges in peripheral blood of receptor mice

表2 不同的時間的血象變化Tab.2 Changes in blood of different times

表3 CD4+、CD8+調節性 T細胞的比較Tab.3 Comparison of the CD4+,CD8+regulatory T cells

圖1 正常小鼠骨髓象(100×10)Fig.1 Normal micebone marrow(100×10)

圖2 再障小鼠骨髓象(100×10)Fig.2 AA micebonemarrow(100×10)

圖3 正常小鼠骨髓病理活檢圖(20×10)Fig.3 Normal mice bone marrow biopsy(20×10)

圖4 再障小鼠骨髓病理活檢圖(20×10)Fig.4 AA mice bone marrow biopsy(20×10)

3 討論

近年來越來越多的研究發現免疫功能異常在AA的發生發展中起主導作用,再生障礙性貧血是一種以造血細胞為靶細胞的自身免疫性疾病[5]。調節性T細胞(Treg)是1999年發現的一群具有免疫抑制功能的T細胞亞群,Treg細胞不同于Th1和Th2細胞,是具有免疫抑制作用的T細胞群體,通過與T細胞直接接觸或分泌抑制性的細胞因子如IL-10、TNF-β發揮免疫抑制作用,在維持機體自身免疫耐受中發揮重要作用。Treg細胞可分為 CD4+-Treg和CD8+-Treg細胞。CD4+Treg細胞是體內自然存在的,能夠分泌 IL-10、IL-4、TGF-β,表達 IL-2Rα,細胞毒性T淋巴細胞抗原(CTLA-1),對效應性T細胞具有抑制作用,是Treg細胞的重要亞群,參與腫瘤的生長、自身免疫性疾病的發生及耐受移植排斥[6]。CD4+CD25+調節性T細胞作為獲得性免疫應答的有機組成部分,通過細胞與細胞間的直接接觸及分泌抑制性的細胞因子發揮免疫抑制作用。CD8+CD28-則是具有免疫抑制作用的調節性T細胞。CD8+CD25+T 細胞高表達 FOXp3、CCR8、CTLA-4 以及GITR,和腫瘤壞死因子受體-2(TNFR2),這些細胞經活化后表達CTLA-4和TGF-β。CD8+CD25+的胸腺細胞通過細胞間的直接接觸,抑制靶細胞上IL-2受體α鏈的表達,從而抑制CD25-T細胞的增殖,它們的這種抑制作用可用抗CTLA-4抗體和抗TGF-β抗體去除。CD8+CD28-細胞將顯著地抑制自身免疫性腦脊髓炎的發生和發展(EAE)[7]。CD8+CD28-亞型表達CD101、CD103。CD62L是介導自然生成的外周T淋巴細胞歸巢的表面受體,有可能的機制是阻止T淋巴細胞的歸巢可以改變針對移植物的免疫反應和免疫排斥[8]。大量的動物實驗證明,調節性T細胞數量缺乏和功能紊亂將導致嚴重或致命的自身免疫性疾病。調節性T細胞組成性表達多種與活化/記憶性T細胞相關的細胞表面分子,其中主要是CD25、CD103、CD62L、CD152、GITR。這些標記的表達使得它們能夠用于分離和研究調節性T細胞。

本實驗選用雄性B6和雌性BABL/cBy培育生成cByB6F1,利用父本的淋巴細胞,經過靜脈注射給子代,誘導產生了骨髓造血功能的衰竭,表現為在2～3周時間內出現RBC、WBC、Plt的逐漸下降,最后出現全血細胞的減少,骨髓象表現為有核細胞增生低下,淋巴細胞比例相對增高,非造血細胞易見,接近于人類的再生障礙性貧血標準。根據文獻報道,受體小鼠沒有出現脫發、腸道炎癥、腹瀉,或其他GVHD的表現[4]。在我們的實驗中,可見脾臟和肝臟的點狀壞死,但沒有出現皮膚、腸道病變,受體小鼠因造血衰竭死亡,與文獻報道相似。我們的實驗中 ,發現了CD4+CD25+和CD8+CD25+、CD8+CD28-調節性T細胞表達的顯著性降低(P＜0.05)。這可能與調節性T細胞的減低,對自身免疫反應的抑制作用削弱有關。在再障模型中,T-regs的顯著降低,使得活化的T細胞對自身造血組織產生了強烈的免疫反應,而缺乏了T-regs對針對自身抗原的免疫抑制作用。已有的研究說明CD4+CD25+T-regs具有免疫抑制功能,將去除CD25+細胞的CD4單陽性T細胞過繼轉移給T細胞缺陷小鼠,能導致各種器官特異性的自身免疫病,而將CD4+CD25+T-regs和CD4單陽性T細胞共同過繼轉移則能防止自身免疫性疾病的發生[9]。再障患者中T淋巴細胞處于活化狀態,并于發病前T細胞向骨髓組織選擇性定向歸巢活化增殖,繼而引發骨髓干/祖細胞損傷和造血衰竭。我們的試驗也證實了這一點,CD62L表達的異常升高,介導了活化的T淋巴細胞向骨髓組織的歸巢,而調節性T細胞的比例下調,使對于活化的T淋巴細胞對于自身的免疫應答反應的抑制作用減弱,從而產生了針對自身骨髓的損傷反應。已有研究顯示,在類風濕關節炎患者,其病變關節液中調節性T細胞比例明顯下調,關節滑液中分離的CD4+CD25+T細胞高表達CTLA-4、GITR、CD62、MHCII等細胞活化分子,體外上述細胞不能抑制CD4+T細胞分泌TNF-α及IFN-γ,RA患者關節滑液中的CD4+CD25+T細胞并非調節性T細胞,而是活化的CD4+T細胞(CD25系IL-2R,T細胞活化后表達上調)[10]。

我們的實驗證明了調節性T細胞在再生障礙性貧血中發病機制所起的作用,調節性T細胞的降低,使它對針對自身抗原的免疫反應的抑制作用減弱,出現了針對自身骨髓的免疫反應,使造血前體細胞和造血干細胞受到免疫損傷。通過我們的實驗,證實了調節性T細胞在再生障礙性貧血發病機制中的作用,也為治療再障提供了新的思路。深入研究T-regs的生物學特征、功能將有助于進一步闡明機體免疫調節機制,認識在再障發病中的病理、生理機制,有利于人為進行有效的免疫調控,并利用提純、體外擴增的T-regs進行免疫治療。以調節性T細胞為靶點,通過藥物影響這群細胞的功能,進而調節免疫,可能為我們治療多種免疫相關疾病提供新的途徑。進行有效的免疫調控,為自身免疫性疾病的免疫治療提供新途徑。

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