補腎活血方對小鼠卵泡刺激素及其受體mRNA表達的影響

胡興文 王維鵬 洪 媛 楊 華 秦 柳 (湖北省婦幼保健院檢驗科,武漢430070)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指女性在40歲前出現卵巢功能衰退,主要表現為月經稀發或持續閉經,常伴烘熱、多汗、失眠等軀體癥狀,及出現焦慮、抑郁、敏感、敵對、壓抑,陰道干澀,性交痛、性生活不滿意等不適,是一類嚴重影響婦女身心健康的疾病[1]。治療多采用西藥人工周期療法,該法服藥方便,見效快,并能明顯改善患者癥狀、誘導人工月經、預防生殖器萎縮和骨質疏松,但該方法治療往往停藥后易于復發,而且長期使用激素尤其是雌激素有增加子宮內膜癌、高乳腺癌發病率等副作用[2]。有許多研究者采用復方中藥進行治療,認為補腎活血復方中藥具有補腎精、養精血、化瘀血之功,本研究想了解補腎活血復方中藥對免疫性卵巢早衰小鼠FSH和FSHR mRNA表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 BALB/c雌性小鼠122只(華中科技大學同濟醫學院動物實驗中心購買),體重18～22克。

1.2 補腎活血方 共需要補腎活血方組方中藥2.6千克。組成如下:熟地 400克,菟絲子400克,山萸200克,鹿角膠200克,補骨脂200克,女貞子200克,白芍200克,當歸 200克,川芎 200克,桃仁200克,紅花200克。中藥由湖北省婦幼保健院中藥房提供。

1.3 動物模型制備 稱取2 mg ZP3透明帶多肽粉末(杭州中肽生化有限公司生產),加入2 ml三蒸水配成溶液,取1 ml溶液稀釋至6 ml溶液,與弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)按1∶1比例配制成免疫試劑,與弗氏不完全佐劑(美國Sigma公司)按 1∶1比例配制成免疫強化試劑。按文獻方法造模[3],每鼠取0.15 ml免疫試劑皮下多點注射雙后腳掌及腹腔,14天后以免疫強化試劑0.15 ml皮下多點注射小鼠雙后腳掌及腹腔加強免疫。

1.4 分組及給藥 隨機分為空白對照組、模型組、潑尼松組、倍美力組,補腎活血中藥低劑量組,補腎活血中藥中劑量組,補腎活血中藥高劑量組。除空白對照組外,模型組及其余組小鼠于雙后腳掌及腹腔皮下多點注射免疫試劑0.15 ml,空白對照組注射生理鹽水0.15 ml;14天后各組動物于雙后腳掌及腹腔皮下多點注射新鮮配制的免疫強化試劑,空白對照組再次注射生理鹽水0.15 ml;第二次免疫后第6天各藥物組開始灌胃給藥。其中潑尼松(廣東華南藥業集團有限公司)按每天20mg/人計,根據小鼠與人的體表面積進行換算,用冷開水溶解藥片,制成溶液,調整濃度,使每毫升溶液含潑尼松0.17 mg。倍美力(愛爾蘭惠氏藥廠生產)按每天0.625 mg/人計,根據小鼠與人的體表面積進行換算,用冷開水溶解藥片,制成溶液,調整濃度,使每毫升溶液含己烯雌酚0.009 mg。中藥組除鹿角膠、補骨脂外,其余藥物均水煎后去滓,納鹿角膠及補骨脂烊化、濃縮、調配濃度,使低劑量補腎活血溶液每毫升含生藥0.5克;中劑量補腎活血溶液每毫升含生藥1克;高劑量補腎活血溶液每毫升含生藥2克。每只小鼠灌胃量均為0.3 ml,空白對照組和模型組灌胃相同量蒸餾水。連續灌胃4周,每周休息1天。

1.5 取材 小鼠摘眼球取血,待血液凝固后,室溫下以3 000 r/min離心15分鐘,取上清液,分裝于Eppendorf管,-80℃保存備用;頸椎脫臼處死小鼠后取雙側卵巢,取1個卵巢于滅菌的Eppendorf管中,立即置于-80℃保存備用。

1.6 ZPAb、FSH和E2檢測 酶聯免疫競爭(ELISA)法進行檢測,試劑由美國Groundwork Biotechnology Diagnosticate公司生產,嚴格按照說明書操作,酶標儀anthos2010(奧地利)。

1.7 總RNA的提取 取小鼠1個卵巢組織用TRIZol的提取方法進行提取,提取的RNA加DEPC處理水40μl溶解,-80℃保存備用。

1.8 FSHR mRNA檢測 用實時熒光定量逆轉錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)檢測,試劑由中山大學達安基因股份有限公司生產,實時熒光定量PCR儀ABI7300(美國)。(1)探針序列:5′FAM-CAG ATG CATTTA ATCCATGTGAAGACA-TAMRA 3′;上游引物 F:5′-ATGTGA CCT GCT CGC CAA AG-3′;下游引物 R:5′-TGA TGGCCA GGA TGCTGA TA-3′。(2)逆轉錄反應體系:逆轉錄buffer 4μl;下游引物R(10 pmol/μl)0.4 μl;dNTPs 0.5 μl;逆轉錄酶(MMLV)1μl;DEPC 水10.1μl;RNA 模板4μl,總體積20μl。反應條件:37℃1小時,然后 95℃3分鐘。(3)擴增反應體系:定量 PCR buffer 10μl;上游引物F(10 pmol/μl)1 μl;下游引物 R(10 pmol/μl)1 μl;dNTPs(10 mmol/L)1 μl;熒光探針(5 pmol/μl)1 μl;Taq酶1μl;cDNA 、陽性標準品5μl;ddH2O 30μl,總體積50 μl。反應條件:93℃2分鐘,然后93℃30秒,55℃45秒,共 40循環。標準曲線的濃度梯度為:108、107、106、105、104、103拷貝/μl。

2 結果

2.1 ZPAb檢測結果 模型組小鼠血清ZPAb的含量明顯比空白對照組高,差異有非常顯著性意義(P＜0.001),說明造模成功,模型組小鼠體內產生抗透明帶抗體。其余各組小鼠血清ZPAb的含量與空白對照組比較,差異都沒有統計學意義(P＞0.05),見表 1。

2.2 E2檢測結果 模型組小鼠血清E2的含量比空白對照組低,差異有顯著性意義(P＜0.01),說明透明帶抗體致使小鼠卵巢組織免疫性損傷,卵巢分泌的E2下降。潑尼松組和倍美力組小鼠血清E2的含量與模型組比較,差異沒有統計學意義(P＞0.05)。補腎活血中藥治療組小鼠血清E2的含量與模型組比較,含量均有顯著性升高,差異有非常顯著性意義(P＜0.001)。在補腎活血中藥治療的3組中,小鼠血清E2的含量隨中藥劑量的減少而升高,補腎活血中藥低劑量組與高劑量組比較,差異有顯著性意義(P＜0.05),說明補腎活血中藥低劑量治療時,藥效最大,見表2。

2.3 FSH檢測結果 模型組小鼠血清FSH的含量與空白對照組比較,差異沒有統計學意義(P＞0.05),說明造模沒有影響垂體分泌FSH。潑尼松組和倍美力組小鼠血清FSH的含量與模型組比較,差異沒有統計學意義(P＞0.05)。補腎活血中藥低、中、高劑量組小鼠血清FSH的含量與模型組比較,含量有顯著性升高,差異有顯著性意義(P＜0.05)。補腎活血中藥低劑量組小鼠血清FSH的含量最高,見表3。

表1 各組ZPAb測定結果與空白對照組的比較(ng/ml)Tab.1 Comparison of ZPAb results between each group and blank control group(ng/ml)

表2 各組E2測定結果與模型組的比較(ng/ml)Tab.2 Comparison of E2 results between each group and model group(ng/ml)

2.4 FSHRmRNA檢測結果 模型組小鼠卵巢組織FSHR表達的mRNA量比空白對照組低,但差異沒有統計學意義(P＞0.05);潑尼松組、倍美力組和補腎活血中藥低、中、高劑量組小鼠卵巢組織FSHR表達的mRNA量比模型組高,差異有顯著性意義(P＜0.05),補腎活血中藥低劑量組小鼠卵巢組織FSHR表達的mRNA量最高,見表4。

2.5 小鼠血清E2的含量與FSHR mRNA的關系 不按組分析,把所有小鼠血清E2的含量與其卵巢組織FSHRmRNA表達量進行線性回歸分析,小鼠血清E2的含量與其卵巢組織FSHRmRNA表達量呈正相關關系(R2=0.359,F=64.888,P＜0.001)。

表3 各組FSH測定結果與模型組的比較(ng/ml)Tab.3 Comparison of FSH results between each group and model group(ng/ml)

表4 各組FSH受體表達mRNA測定結果與模型組的比較(copies/μl cDNA)Tab.4 Comparison of FSHR-mRNA results between each group and model group(copies/μl cDNA)

3 討論

自身免疫性卵巢疾病是人類POF產生的原因之一[4],本研究模型組小鼠血清中ZPAb的含量明顯高于空白對照組,免疫接種使模型組小鼠體內產生了抗透明帶抗體;但其余各組小鼠血清中ZPAb的含量與空白對照組比較,沒有統計學差異,可能是西藥和中藥對小鼠產生ZPAb都有一定的抑制作用。透明帶抗體與卵細胞透明帶結合,促使卵泡閉鎖,引起卵泡數目減少,卵巢分泌雌激素、孕激素也相應減少。本研究模型組小鼠血清中E2的含量明顯低于空白對照組,卵巢組織表達的FSHR也比空白對照組的低,表明模型組小鼠卵巢受到抗透明帶抗體的損傷,卵巢功能破壞。卵巢早衰的內分泌特征主要表現為高FSH、低E2,是由于生殖器官分泌性激素的功能和血清中性激素的水平,直接受下丘腦—垂體—性腺軸調控。POF血清中雌激素、孕激素減少時,造成對垂體FSH、LH的抑制減弱,導致血清FSH、LH水平升高。

中藥有多系統、多環節的整體調節作用,能提高卵巢對促性腺激素的反應性,進而恢復和改善卵巢功能[5],本研究顯示,與模型組比較時,潑尼松和倍美力都沒有使小鼠血清中E2和FSH的含量發生明顯改變,但補腎活血復方中藥能使小鼠血清中E2的含量顯著升高,同時血清中FSH的含量也明顯升高,卵巢組織FSHR表達量也升高,其中以補腎活血中藥低劑量治療組升高最為顯著。本研究中補腎活血復方中藥使小鼠血清中E2和FSH的含量都升高,與其他報道不一致,如董莉等[6]研究報道卵巢早衰婦女服用補腎活血方治療后,血清中E2的含量明顯升高,而FSH明顯降低;梁欣韞等[7]用中藥復方育泡飲治療免疫性卵巢早衰小鼠和朱玲等[8]用中藥復方左歸丸治療免疫性卵巢早衰小鼠,都能使小鼠血清中E2的含量明顯升高,而FSH明顯降低。

補腎活血復方中藥的治療機理可能是促使垂體分泌FSH增加,并促使卵巢顆粒細胞膜表面的FSH受體表達量明顯增加,提高卵巢組織對FSH的反應性,繼而促進卵巢分泌E2量的增加。體外將FSHR質粒轉染大鼠顆粒細胞,證實顆粒細胞表面FSHR的密度越高,信號傳導功能越大[9]。Cai等[10]研究發現,顆粒細胞FSHR表達水平與卵巢的反應性有關,低反應組患者FSHR表達低、卵泡發育少、E2峰值低;而高反應組FSHR表達高、獲卵數多、E2峰值高;另外,FSHR蛋白的表達量與卵泡數和血清E2峰值呈顯著正相關關系。FSH與FSHR相結合后,激活FSHR啟動子,活化 RNA聚合酶,使之與模板DNA準確地結合并啟動基因轉錄,引起FSHR基因轉錄后水平的變化,從而介導促性腺激素的反應信號,導致第二信使產生以及激發后續的細胞內反應、顆粒細胞的增殖分化和雌激素的產生,參與卵泡和生殖細胞的發育和成熟,從而影響女性卵巢的生殖和內分泌功能[11]。本研究也顯示,小鼠血清中E2的含量與卵巢組織FSHR表達的mRNA量成正相關關系,小鼠卵巢組織FSHR表達的mRNA量越多,小鼠血清中E2的含量越高,在補腎活血中藥治療的三組中,低劑量治療組小鼠卵巢組織FSHR表達量最多,小鼠血清中E2的含量也最高。

補腎活血中藥使小鼠血清中FSH含量和卵巢顆粒細胞FSHR表達水平同時增高,促使卵巢顆粒細胞分泌的雌激素顯著增加,補腎活血中藥低劑量治療組小鼠血清中E2的含量是模型組的將近4倍。又由于補腎活血中藥促進垂體分泌FSH,干擾了血清中FSH水平受血清中雌激素的負反饋調節作用,這樣就出現了中藥治療組小鼠血清中FSH和E2的含量同時升高。西藥潑尼松和倍美力治療組均沒有使小鼠血清中FSH和E2的含量升高,但也都促使卵巢顆粒細胞膜表面的FSH受體表達量增加。

在不同劑量的補腎活血復方中藥治療的三組中,低劑量治療組使小鼠血清中E2、FSH含量和卵巢組織中FSHR表達的mRNA量最高,說明低劑量補腎活血復方中藥治療的藥效最大,高劑量藥效反而有所下降。

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6 董 莉,姜琳林,曉 倩 et al.補腎活血方對卵巢早衰患者血清FSH、LH、E2及PRL的影響[J].上海中醫藥雜志,2007;41(11):48-49.

7 梁欣韞,牛建昭,王繼峰et al.育泡飲對小鼠自身免疫性卵巢損傷保護作用的實驗研究[J].北京中醫藥大學學報,2008;31(4):243-246.

8 朱 玲,羅頌平,許麗綿.免疫性卵巢早衰小鼠生殖能力的研究[J].中國醫藥導報,2008;5(6):13-15.

9 Donadeu FX,Ascoli M.The differential effects of thegonadotropin receptors on aromatase expression in primary cultures of immature rat granulosa cells are highly dependent on the density of receptors expressed and the activation of the inositol phosphate cascade[J].Endocrinology,2005;146(9):3907-3916.

10 Cai J,Lou H Y,Dong M Y et al.Poor ovarian responsetogonadotropin stimulation is associated with low expression of follicle-stimulating hormone receptor in granulosa cells[J].Fertil Steril,2007;87(6):1350-1356.

11 Hermann B P,Heckert L L.Transcriptional regulation of the FSH receptor:new perspectives[J].Mol Cell Endocrinol,2007;260-262:100-108.