黑大蒜提取物對小鼠細胞免疫應答影響的初步探討

馮永輝 王慶輝 王美茹 張 佩 王大南 呂昌龍 (中國醫科大學免疫研究所,沈陽110001)

大蒜作為一種常見的植物,性溫味辣,化學組成十分復雜,其含有的生物活性成分超過100種。它的藥用價值主要在于其含硫化合物,其含量是洋蔥、椰菜等高有機硫化合物蔬菜的4倍多[1]。人們在實驗中發現大蒜具有降血脂、降血壓、降血糖、抗腫瘤、抗菌、抗氧化和免疫調節等功效[2,3]。為此,近些年來人們不斷開展對大蒜的研究,提取大蒜油、制備大蒜粉和合成大蒜素等,用于人類的健康保健,并進一步拓寬大蒜的用途。

近年來日本學者發現在控制濕度和溫度的情況下,普通的白大蒜經過一定處理可由白色變成黑色(稱為黑大蒜),黑大蒜無白大蒜原有的辣味,反而帶有甜味,口感好,仍可直接食用。已有研究報道黑大蒜較白大蒜含有更多的氨基酸、有機硫和S-烯丙基-L-半胱氨酸(S-allyl-L-cysteine,SAC)[4],因此與白大蒜相比可能更具有應用前景。然而目前有關黑大蒜對機體免疫功能的影響國內外少見報道。為此,本實驗應用黑大蒜提取物溶液,將其腹腔注射給小鼠,觀察了黑大蒜提取物作為免疫調節劑的作用,為黑大蒜的實際應用提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只BALB/c小鼠,6～8周齡,雌性,體重18～22克,購于中國科學院上海實驗動物中心。

1.2 黑大蒜提取物溶液的制備及動物注射 黑大蒜粉由日本弘前大學佐佐木甚一教授提供。黑大蒜提取物按文獻[4]的方法制備,用無菌生理鹽水配制成1 mg/ml溶液。將動物隨機分為8組,每組5只,1～7組為實驗組,第8組為對照組。實驗組小鼠每天腹腔注射0.1 ml的黑大蒜提取物溶液,對照組每天腹腔注射0.1 ml的生理鹽水,連續注射5天。

1.3 主要試劑 RPMI1640(Thermo)、LDH底物(NBT購自Sigma公司、NAD購自中國科學院生物研究所、乳酸鈉購自上海試劑三廠、PMS購自Fluka公司)、NP-40(Fluka公司)、Griess反應液 (Wako)、Trizol(Invitrogen)、RT-PCR kit(Takara)、IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-αELISA Kit(R&D)、RNA LA PCRTMKit(AMV)Ver.1.1(TaKaRa)、TRIzol(Invitrogen)黑大蒜提取物由日本弘前大學佐佐木甚一教授惠贈。

1.4 樣品的采集 于末次注射后的第1～7天,從第1組小鼠開始,連續每天頸椎脫位處死1組小鼠,第8組小鼠于第7天處死。常規無菌取脾,制備脾細胞懸液,調整細胞濃度至1×107ml-1。一部分用于NK細胞殺傷活性的檢測;另一部分細胞懸液接種于24孔板中,每個樣品設3個復孔,每孔接種0.5ml,置5%CO2、37℃培養箱培養48小時,收集上清液用于NO、IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α分泌水平的檢測。

1.5 NK細胞活性的測定[5]

1.5.1 效應細胞的制備 將上述制備的脾細胞懸液作為效應細胞,濃度為 1×107ml-1。

1.5.2 靶細胞的制備 取10%FBS-RPMI1640培養液,傳代培養YAC-1細胞,將傳代后24小時的YAC-1細胞調整細胞濃度為1×105ml-1。

1.5.3 NK細胞活性的測定 取96孔細胞培養板,每孔加靶細胞懸液0.1 ml,實驗組每孔加效應細胞懸液0.1ml,最大釋放組每孔加1%NP-40于靶細胞中,自然釋放組每孔加RPMI1640液0.1 ml代替效應細胞,置5%CO2、37℃培養箱培養2小時,每孔加0.05 ml細胞培養液,1 500 r/min離心10分鐘,每孔取上清0.1 ml加LDH底物混合液0.1 ml作用20分鐘后,每孔加入30μl終止液,最后用490 nm的濾光片測 OD值,并計算 NK活性。NK細胞活性(%)=

1.6 NO的檢測(Griess法)[6]收集培養的脾細胞上清,與等體積的Griess試劑室溫反應10分鐘,檢測小鼠脾細胞培養上清中NO-2含量。用NaNO2作為標準品,酶標儀檢測570 nm處的OD值。

1.7 脾細胞上清中IL-2、IL-4、IFN-γ和 TNF-α水平的檢測收集的實驗組和對照組小鼠的脾細胞培養上清,采用ELISA 法檢測上清中 IL-2、IL-4、IFN-γ和TNF-α的水平,具體方法嚴格按照說明書進行。

1.8 脾細胞FasLmRNA表達水平的檢測 按照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA,然后按照RNA LA PCRTMKit Ver.1.1說明將提取的總RNA反轉錄為cDNA。再以 cDNA為模板,PCR擴增FasL及βactin基因片段。FasL 引物:sense 5′-AAT TAC CCA TGTCCCCAGATC-3′,antisense5′-GCTGCTGTGGGC CCA TAT TG-3′;β -actin 引物:sense 5′-TCA GAA GGA CTC CTA TGT GG-3′,antisense 5′-TCT CTT TGA TGT CACGCA CG-3′;PCR循環參數:95℃變性1分鐘,55℃退火1分鐘,72℃延伸2分鐘,共35個循環;擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳后,掃描分析。

2 結果

2.1 黑大蒜提取物對BALB/c小鼠NK細胞的殺傷活性的影響 在連續5天給予小鼠腹腔注射黑大蒜提取物后,比較實驗組和對照組小鼠的NK細胞殺傷活性,結果顯示:與對照組相(5.82%±1.38%)比,黑大蒜提取物處理4～6天后,實驗組小鼠的NK細胞殺傷活性顯著性升高,并在第 5天達到峰值(11.21%±1.17%),隨后逐漸下降,結果見圖1。

2.2 黑大蒜提取物對脾細胞培養上清中NO產生的影響 從黑大蒜提取物處理后的第3天到第7天,實驗組小鼠NO-2始終處于較高的分泌水平,與對照組(11.58±0.86μmol/L)相比,均具有顯著性差異(P＜0.001),結果見圖2。

圖1 黑大蒜提取物對小鼠NK細胞殺傷活性的影響Fig.1 The effect of black garlic extracts on thecytotoxicity of NK cells

圖2 黑大蒜提取物對脾細胞培養上清NO分泌水平的影響Fig.2 The effect of black garlic extracts on the NO production in cultured supernatant of spleen cells

圖3 黑大蒜提取物對脾細胞培養上清中Th1/Th2細胞因子的影響Fig.3 The effect of black garlic extracts on the Th1/Th2 cytokines'production in cultured supernatant of spleen cells

圖4 脾細胞FasL mRNA表達水平的檢測結果Fig.4 Thedetection results of FasL mRNA expression in spleen cells Note:M.Marker;1-7.Groups1-7;8.Control group.

表1 脾細胞FasL mRNA相對表達水平Tab.1 The relative expression level of FasL mRNA in spleen cells

2.3 黑大蒜提取物對脾細胞培養上清中Th1/Th2細胞因子的影響 在給予小鼠連續注射5天黑大蒜提取物后,實驗組小鼠脾細胞培養上清中IL-2的分泌水平在處理后第 6天有顯著升高,與對照組(20.14±3.88 pg/ml)相比,有顯著的統計學意義(P＜0.05)。TNF-α的水平從處理后第1天就開始明顯升高(P＜0.01),在第3天達到峰值(68.73±0.64 pg/ml),隨后下降,但一直到第7天,均高于對照組(27.36±8.30 pg/ml)。IFN-γ的分泌水平在處理結束后也有顯著升高,其中在第 3天達到峰值(105.05±55.73 pg/ml),隨后下降,到第7天接近對照組水平。IL-4的分泌水平在處理后一直低于對照組(19.98±2.13 pg/ml),其中第3、4、5天的表達水平均顯著低于對照組(P＜0.01),但是變化均在基線范圍內,見圖3。

2.4 脾細胞FasL mRNA表達水平的檢測結果 通過半定量RT-PCR技術檢測了小鼠脾細胞FasL mRNA的相對表達水平(圖4)。給予小鼠腹腔注射黑大蒜提取物后,各實驗組脾細胞FasL mRNA的表達水平與對照組相比均未見顯著性差異(P＞0.05,表1)。這說明黑大蒜提取物刺激機體后,脾細胞FasL mRNA的表達并未出現有意義的增強。

3 討論

近年來,有關大蒜功效的研究者越來越聚焦于大蒜的各種含硫化合物而不是大蒜素。含硫化合物可分為有氣味脂溶性的(如diallyl-disulfide,DADS)和無氣味水溶性的(如SAC)。水溶性的較脂溶性的效應功能更為穩定。Sasaki等[4]對黑大蒜的成分與普通大蒜的成分進行了對比分析,結果發現前者SAC的含量是后者的8倍。進一步研究結果還發現黑大蒜具有明顯的抗氧化、抗腫瘤和抗菌作用。然而其作用機制尚不清楚,為此本論文從免疫學角度對黑大蒜的抗腫瘤和抗菌的機制進行了探討。

NK細胞作為參與機體固有免疫應答的一類重要細胞,具有細胞毒性效應,能消除機體中的異常細胞,尤其是病毒感染或腫瘤突變的細胞。有流行病學數據表明大蒜的攝取量與胃腸道腫瘤的抑制性具有相關性[7]。我們的研究結果顯示黑大蒜能通過增強NK細胞活性,提高對機體異常細胞的監視、清除功能。但脾細胞中FasL mRNA的表達水平未見明顯變化,提示NK細胞殺傷活性的增強不是通過Fas/FasL殺傷途徑而是可能通過其他途徑來實現的。

NO作為一種非特異性免疫效應分子,在誘導瘤細胞凋亡、抗菌、抗病毒及胞內寄生蟲中,發揮著重要的免疫防御作用。Pedraza-Chaverrí等[8]曾報道大蒜能促進體內NO合酶的合成,從而提高NO表達水平。參與機體免疫應答的另一種免疫調節因子——TNF-α,不僅能夠直接抑制或殺傷腫瘤細胞,而且具有激活巨噬細胞和中性粒細胞功能以及促進T、B淋巴細胞增殖、分化等作用,促進單核巨噬細胞及其它細胞產生細胞因子 IL-1、IL-6、IL-8、IFN-γ以及TNF-α本身,發揮重要的免疫調節作用。以NO和TNF-α為代表的效應分子,對于機體發揮固有免疫具有重要的意義,本實驗結果顯示脾細胞上清中的NO和TNF-α分泌水平在黑大蒜提取物刺激小鼠之后均有提高,進一步表明黑大蒜對固有細胞免疫應答具有一定的刺激作用。巨噬細胞是體內這兩種效應分子的主要來源,Cho等[9]人報道大蒜素能抑制腹腔巨噬細胞在缺少營養條件下的凋亡,因此,我們的實驗結果也間接提示黑大蒜提取物對巨噬細胞的功能可能具有增強效應,其具體機制有待于進一步深入研究。在本實驗中,以IL-2和IFN-γ為代表的Th1型細胞因子分泌水平明顯增強,這與黑大蒜在機體抗腫瘤和抗感染的免疫效應密切相關,Ghazanfari等[10]發現大蒜能夠誘導利氏曼原蟲感染的小鼠體內產生高水平的IL-2和IFN-γ,但是降低IL-4和IL-10的表達水平。本實驗中的IL-4分泌水平略有降低,其變化均在基礎范圍內,我們的結果表明黑大蒜提取物能誘導機體產生一種強有力的Th1型免疫應答。

本實驗發現黑大蒜提取物能夠顯著增強NK細胞殺傷活性,提高NO水平,以及增強Th1細胞免疫應答,由此提示黑大蒜提取物能明顯增強小鼠的細胞免疫應答,這為黑大蒜作為一種免疫調節劑在應用方面提供了有意義的實驗依據。有關黑大蒜提取物的免疫調節作用是否優于普通的白大蒜有待進一步研究。

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10 Ghazanfari T,Hassan ZM,Ebtekar M et al.Garlic Inducesa shift in cytokine pattern in leishmania major-infected BALB/c mice[J].Scand J Immunol,2000;52(5):491-495.