粘膜佐劑LTB優化的抗淋病ltB-nspA融合基因疫苗鼻飼免疫效果研究①

王 健 胡四海 戴志兵 胡耀華 張愉快 余敏君 (南華大學病原生物學研究所,衡陽421001)

淋病奈瑟菌俗稱淋球菌,是引起淋病的病原菌,淋病是我國目前發病人數最多的性傳播疾病,感染淋球菌還可增加HIV傳播的危險性[1]。如何有效控制和預防淋病,成為全世界普遍關注的公共衛生問題,而研制出有效的疫苗,是預防和控制淋病的關鍵。Plante等[2]首先克隆了奈瑟氏淋球菌的表面蛋白A(Neisseria gonorrhoeae surface protein A,NspA)基因,發現NspA抗原不但能在淋球菌表面持續表達,而且高度保守、具有較強免疫原性,是一個頗具潛力的淋球菌疫苗候選抗原。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(Bsubunit of Escherichia coli heat-labile entero-toxin,LTB)是繼霍亂弧菌腸毒素CTB之后發現的一種有效的粘膜佐劑,它去除了大腸桿菌不耐熱腸毒素的毒性A亞單位,仍保留較好的粘膜佐劑活性[3]。抗淋病免疫主要靠體液免疫,尤其是粘膜免疫。為了研究具有較強粘膜保護能力的淋球菌疫苗,本課題組將 nspA和ltB基因融合,構建了pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因疫苗。本研究在此基礎上將該融合基因疫苗通過鼻飼途徑免疫雌性BALB/c小鼠,檢測其所誘發的特異性體液免疫應答(尤其是粘膜免疫應答)和細胞免疫應答水平,為研制高效抗淋病基因疫苗提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體、抗原及實驗動物 E.coli JM109本室保存;pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1(-)/ltB 、pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA載體(本課題組已成功轉染真核細胞)由本室保存;重組蛋白NspA由南華大學病原生物學研究所本課題組提供;SPF級4～6周齡雌性BALB/c小鼠購自南華大學實驗動物學部。

1.1.2 主要試劑 質粒小量提取試劑盒購自北京博大泰克生物工程有限公司;限制性內切酶(BamHⅠ、HindⅢ)購自大連寶生物工程公司。DNA ladder購自晶美生物工程公司;二抗:HRP標記的羊抗鼠IgG和HRP標記羊抗鼠sIgA分別購自Abcam和Sigma公司;IFN-γ含量測定試劑盒購自晶美生物公司;其他試劑為進口分裝或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 核酸疫苗的制備 將本室保存的真核質粒pcDNA3.1(-)/ltB-nspA、pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB 、pcDNA3.1(-)轉化入 E.coli JM109,在氨芐抗性的LB平板上培養14～18小時后挑選菌落克隆擴增,提取質粒經PCR和BamHⅠ與HindⅢ雙酶切鑒定,篩選陽性菌落。將轉化成功并鑒定正確的重組克隆菌大量擴增培養,去內毒素質粒提取試劑盒大量提取真核質粒,核酸蛋白定量分析儀測定濃度后,無菌PBS調整核酸濃度為2 000μg/ml。

1.2.2 動物免疫 選取4～6周齡雌性BALB/c健康小鼠60只,隨機分為5組,即:pcDNA3.1(-)/ltB-nspA、pcDNA3.1(-)/nspA為實驗組;pcDNA3.1(-)/ltB、空質粒pcDNA3.1(-)和PBS空白組為對照組,每組均為12只。實驗組接種pcDNA3.1(-)/ltB-nspA、pcDNA3.1(-)/nspA重組質粒,對照組接種pcDNA3.1(-)/ltB、pcDNA3.1(-)空質粒和無菌PBS,均接種40 μl。分別于初次免疫后的第2周、4周再免疫2次,共免疫3次,每只80μg/次。

1.2.3 免疫小鼠標本的收集 每次免疫前一天及末次免疫后2周收集小鼠生殖道灌洗液100μl;收集小鼠尾靜脈血50～80μl分離血清,所有標本于-20℃保存;末次免疫后2周剖殺小鼠,無菌取小鼠脾臟,經200目尼龍紗布網濾過-制成單個細胞懸液備用。

1.2.4 小鼠生殖道粘膜特異性sIgA的檢測 以純化、復性的重組蛋白NspA為抗原包被ELISA板,以小鼠生殖道灌洗液標本作一抗,采用間接ELISA法檢測sIgA的水平。將重組蛋白用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋至 40.0μg/ml,每孔100μl包被 ELISA板,4℃過夜;用PBST洗滌 3次;用封閉液 4℃封閉12小時;PBST洗滌3次,5分鐘/次。加各組小鼠生殖道貫洗液標本,100μl/孔,37℃溫育2小時,PBST洗滌3次,5分鐘/次;再加HRP標記的羊抗鼠sIgA 100μl/孔,37℃溫箱中溫育1小時,PBST洗滌3次,5分鐘/次。最后加入新配置的TMB顯色液顯色并于酶標儀上讀取各孔A450值。

1.2.5 小鼠血清中特異性IgG的檢測 以純化、復性的重組蛋白NspA為抗原包被ELISA板,以小鼠血清標本作為一抗,以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗,采用間接ELISA法檢測血清IgG水平。其操作方法同上sIgA抗體的檢測。

1.2.6 ELISA雙抗體夾心法檢測IFN-γ產生水平 將無菌收集的小鼠脾細胞加入5 ml 0.83%NH4Cl放置5分鐘溶解紅細胞,1 000 r/min離心5分鐘收集淋巴細胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培養基重懸細胞。臺酚藍染色,調整活細胞數為 6×106ml-1,接種于24孔板中,1 ml/孔;每組的每個培養孔加入特異性抗原NspA 10μg,培養板置37℃5%CO2的培養箱中培養72小時后離心取上清備用;采用雙抗體夾心法檢測IFN-γ含量,具體操作按試劑盒說明書進行。

1.2.7 MTT比色法檢測淋巴細胞的增殖 將無菌收集的小鼠脾細胞加入5 ml 0.83%NH4Cl放置5分鐘溶解紅細胞1 000 r/min離心5分鐘收集淋巴細胞,用含10%小牛血清的RPMI1640培養基重懸細胞。臺酚藍染色,調整細胞濃度為1×106ml-1,加入96孔板,每孔200μl;每只小鼠脾淋巴細胞分成兩組,特異性抗原NspA刺激組,無刺激的陰性對照組,其中每組重復4孔。NspA刺激組每孔加入 2 μg,混勻后,置37℃、5%CO2培養 72 小時 。于終止培養前4小時每孔加入5 mg/ml的MTT 20μl,繼續培養4小時后棄上清,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl,震蕩溶解15分鐘,570 nm波長測定各孔的A570值。刺激指數(SI)=實驗組 A570值/空白對照組 A570值。并用刺激指數來評價小鼠脾淋巴細胞的增殖程度。

1.3 統計學處理 運用SPSS16.0軟件進行分析。抗體水平、脾細胞刺激指數及細胞因子水平以±s表示,組間均數的比較采用方差分析,以 P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 真核重組質粒的鑒定 重組質粒pcDNA3.1(-)/ltB 、pcDNA3.1(-)/nspA、pcDNA3.1(-)/ltB-nspA經PCR和雙酶切鑒定,1.0%瓊脂糖凝膠電泳,均能得到目的條帶,大小分別約為ltB(372 bp)、nspA(525 bp)和 ltB-nspA(900 bp),見圖1。

2.2 小鼠生殖道粘膜NspA特異性sIgA抗體水平的檢測 以重組蛋白NspA作檢測用抗原包被ELISA板,間接ELISA法對各免疫組小鼠每次免疫前一天和末次免疫后2周收集的小鼠生殖道灌洗液行sIgA檢測,結果顯示:在不同時間的免疫中,第4周、6周pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因組小鼠生殖道粘膜sIgA水平(A450:0.296±0.045、0.316±0.048)和pcDNA3.1(-)/nspA 單基因組生殖道粘膜sIgA水平(A450:0.224±0.038、0.249±0.040)均明顯高于 pcDNA3.1(-)/ltB 、pcDNA3.1(-)、PBS組(P ＜0.01);此外,第4周、6周 pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因組小鼠生殖道粘膜sIgA水平明顯高于pcDNA3.1(-)/nspA單基因組(P＜0.05),見圖2。

圖1 真核重組載體經 PCR和 BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定圖譜(1.0%瓊脂糖凝膠電泳)Fig.1 Profile of PCR products and digested products by BamHⅠ,HindⅢ of eukaryotic recombinants(1.0%agerose gel electrophoresis)

2.3 小鼠血清NspA特異性IgG抗體的檢測 以重組蛋白NspA作檢測用抗原包被 ELISA板,間接ELISA法對各免疫組小鼠每次免疫前一天和末次免疫后2周收集的小鼠血清行IgG檢測,結果顯示:在不同時間的免疫中,第4周、6周 pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因組小鼠血清IgG水平(A450:0.521±0.029、0.643±0.156)和pcDNA3.1(-)/nspA 單基因組血清IgG水平(A450:0.500±0.036、0.595±0.142)均明顯高于pcDNA3.1(-)/ltB 、pcDNA3.1(-)、PBS組(P＜0.01);但pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因組與pcDNA3.1(-)/nspA單基因組小鼠血清中IgG水平差異不顯著(P＞0.05),見圖3。

2.4 脾淋巴細胞培養上清IFN-γ水平的檢測 按照說明書建立IFN-γ檢測的標準方程、繪制標準曲線。檢測結果顯示pcDNA3.1(-)/nspA和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA免疫組小鼠脾淋巴細胞培養上清中IFN-γ的水平明顯高于 pcDNA3.1(-)/ltB、空質粒 pcDNA3.1(-)和PBS對照組(P＜0.01);但 pcDNA3.1(-)/nspA和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA兩組間IFN-γ的水平無顯著性差異(P＞0.05),見表1。

圖2 小鼠生殖道抗NspA特異性sIgA抗體水平Fig.2 sIgA levels of NspA in different intranasally immunized groups

圖3 小鼠生殖道抗NspA特異性IgG抗體水平Fig.3 IgG levels of NspA in different intranasally immunized groups

表1 免疫小鼠脾淋巴細胞刺激指數(SI)及培養上清IFN-γ含量(pg/ml)Tab.1 Stimulation index,IFN-γ(pg/ml)in cultured supernatant of splenic lymphocyte from immunized mice

2.5 MTT比色法檢測脾淋巴細胞的增殖反應 用特異性抗原NspA刺激后,pcDNA3.1(-)/nspA和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA免疫組小鼠的脾淋巴細胞刺激指數明顯高于 pcDNA3.1(-)/ltB、空質粒 pcDNA3.1(-)和PBS對照組(P＜0.01),但pcDNA3.1(-)/nspA和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA兩組間差異不顯著(P＞0.05),見表1。

3 討論

核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因直接導入動物體內,并通過宿主細胞的表達系統合成抗原蛋白,刺激機體產生細胞免疫和體液免疫應答,對病原體和腫瘤等產生免疫力的基因疫苗。基因疫苗在體內的抗原表達和遞呈過程與病原體的自然感染相似,能直接遞呈并啟動機體免疫系統,誘導機體產生體液免疫及細胞免疫應答。作為第三代疫苗,與第一代疫苗(減毒、滅活疫苗)及第二代疫苗(亞單位疫苗)相比,因其高效 、持久、廣譜、簡便、廉價、無致病性等優勢而得到廣泛的研究和應用[4,5]。

淋球菌NspA是淋球菌最具特征的外膜蛋白,不但能在淋球菌表面持續表達,而且高度保守、具有較強免疫原性,是一個頗具潛力的淋球菌疫苗候選抗原。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)是大腸桿菌不耐熱腸毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin,LT)分子的非毒性結合亞單位,能與大多數細胞(包括上皮細胞、白細胞)表面的GM1神經節苷酯結合,將其與目的抗原混合或偶聯于目的抗原,通過粘膜免疫途徑免疫動物,可以廣泛激活粘膜免疫系統,在粘膜表面產生高效價的特異性的sIgA抗體,而且在血循環中產生高效價的IgG抗體,同時也可誘發細胞免疫應答,是目前所知最有效的粘膜佐劑之一[6]。抗淋病免疫主要靠體液免疫,尤其是粘膜免疫,誘導高效的粘膜免疫應答,產生粘膜保護力是評價淋球菌疫苗效果的最重要的指標。實驗證明,粘膜途徑免疫不僅能有效的誘發粘膜免疫,同時又可誘發系統免疫應答[7,8]。以 LTB作為粘膜佐劑,促進疫苗抗原產生有效的粘膜免疫應答,是研制經粘膜感染病原體疫苗的策略之一。

此外,選擇合適的免疫途徑也十分重要。Zhu等[9]用淋球菌外膜囊泡抗原通過鼻粘膜途徑免疫BALB/c小鼠,發現可在小鼠生殖道灌洗液中檢測到較高水平的特異性sIgA,血清及生殖道灌洗液中均可檢測到特異性IgG。由此可見,疫苗抗原經粘膜途徑免疫能有效誘導粘膜免疫應答。常用的粘膜免疫方法主要包括胃腸道、鼻腔、生殖道等。鼻腔免疫因避免了胃腸道酸性環境及酶對抗原的破壞、操作簡便易行而被廣泛采用。

本研究采用本課題組構建的淋球菌NspA與大腸桿菌LTB融合基因疫苗,經粘膜途徑(鼻飼)免疫雌性BALB/c小鼠,探討粘膜佐劑優化的核酸疫苗誘導的體液免疫及細胞免疫水平,尤其是粘膜sIgA水平。結果顯示:ltB-nspA融合基因組及nspA單基因組小鼠生殖道局部sIgA及血清IgG水平均明顯高于pcDNA3.1(-)/ltB、空質粒pcDNA3.1(-)和 PBS對照組(P＜0.01),表明經粘膜途徑免疫后基因疫苗誘導產生了較高水平的體液免疫應答;ltB-nspA融合基因組sIgA水平明顯高于nspA單基因組(P＜0.05),表明粘膜佐劑LTB能輔佐NspA誘導小鼠產生更強的粘膜免疫應答,與戴志兵等[10]LTB優化的抗淋病LTB-PorB重組蛋白的免疫活性的研究結果基本一致,這對有效阻斷淋球菌對粘膜上皮細胞的粘附,從而阻斷其進一步對宿主細胞的感染具有重要意義。小鼠脾淋巴細胞經重組抗原NspA刺激后,基因疫苗pcDNA3.1(-)/ltB-nspA組和pcDNA3/1(-)/nspA組的脾淋巴細胞刺激指數和培養上清中IFN-γ含量均明顯高于 pcDNA3.1(-)/ltB、空質粒pcDNA3.1(-)和PBS對照組(P＜0.01),表明核酸疫苗經粘膜免疫小鼠后,也能誘導小鼠產生較強的特異性細胞免疫。

上述研究結果表明,基因疫苗pcDNA3.1(-)/nspA和pcDNA3.1(-)/ltB-nspA均能誘導較高水平的體液免疫及細胞免疫應答,尤其是 ltB-nspA融合基因組較nspA單基因組誘導產生了更高水平的粘膜特異性sIgA,證實粘膜佐劑LTB能有效輔佐NspA在小鼠生殖道粘膜誘導產生更高水平的粘膜免疫,為進一步研究高效抗淋病基因疫苗提供了部分實驗依據。

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9 Zhu W,Thomas C E,Chen CJ et al.Comparison of immune responses to gonococcal PorB delivered as outer membrane vesicles,recombinant protein,or Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles[J].Infection and Immunity,2005;73(11):7558-7568.

10 戴志兵,胡四海,陳 敏 et al.淋球菌porB和大腸桿菌ltB融合基因的構建、表達及其免疫活性[J].微生物學報,2010;50(4):517-523.