蛇毒C型凝集素家族結構及抗原表位預測①

涂 碩 陳 柯 鐘立鵬 黃春洪 (南昌大學基礎醫(yī)學院生物化學教研室,南昌330006)

血栓栓塞性疾病及其并發(fā)的病變,是最常見的死亡病因之一。血小板作為血栓的主要成分,在血栓特別是在動脈血栓和微血管血栓形成過程中,起著關鍵作用。它通過其表面的膜糖蛋白GPIb-Ⅸ-Ⅴ復合物的α鏈,與血管假性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)結合,產生有力的信號導致血小板激活和聚集,最終導致血栓形成[1]。通過阻斷血小板膜GPIb與vWF的結合是發(fā)展新一代抗血栓藥物的熱點,特別是對于治療動脈血栓和預防再梗具有更大優(yōu)勢。C型凝集素蛋白(C type lectin protein,CLP)是天然的GPIb結合蛋白,能競爭性阻斷vWF與GPIb的結合。例如從五步蛇蛇毒中分離的Agkisacutacin能夠降低全血黏度,延長凝血時間,能特異作用血小板GPIb,早期抑制血小板聚集形成血栓[2]。

C型凝集素蛋白家族是蛇毒中共同存在的一個家族,目前從不同種屬蛇毒分離的CLPs有近100種,其中從五步蛇蛇毒中分離的組分有Agkisacutacin、ACFI/II、Agacutegrin、Agkicetin、Acutus IX/X[3-4]。蛇毒中豐富的CLPs是抗血栓藥物開發(fā)的天然寶庫。然而,蛇毒是一種非常復雜的蛋白質溶液,要從眾多毒素蛋白中分離出目的蛋白,往往需要復雜的工藝。親和層析法是一種高特異性分離方法,常用于血清中抗體的分離,因此,構建CLP免疫親和層析法將可大大提高蛇毒CLPs藥物發(fā)現(xiàn)與分離的效率。實現(xiàn)這種高效率分離的重要前提是制備得到CLP抗體。而欲得到特異性抗體,則首先必須設計并合成蛇毒CLPs共同抗原,與載體蛋白偶聯(lián)后免疫動物才能獲得。本研究利用生物信息學原理與相關軟件,分析蛇毒CLP家族結構特性,并對CLPs的抗原表位進行預測與驗證,確定共有抗原表位肽段。

1 材料與方法

1.1 五步蛇毒C型凝集素蛋白序列比對 從蛋白質數據庫(http://www.expasy.ch/sprot/)中選取五步蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒 CLPs蛋白序列13條,登記號分別是Q8JIW0(ACF1/2 A)、Q8JIW1(Agkisacutegrin B)、Q8AYA3(Agglucetin β2)、Q8AYA4(Agglucetin β1)、Q9DEA1(Agkicetin-C β)、Q9DEA2(Agkicetin-C α)、Q9OWL9(Akitonin)、Q9DEF8(Anticoagulant B)、Q9DEF9(Anticoagulant A)、Q9IAM1(Agkisacutacin A)、Q8JIV8(C-type lectin)、Q8JIV9(Agglucetin α1)、Q8AYA5(Agglucetinα2),采用在線的Align功能進行匹對。選擇與共同序列同源性最高的Q8AYA3進行結構和抗原表位預測。

1.2 蛇毒C凝集素二級結構及線性抗原表位預測 應用DNAstar Protean程序模塊預測Q8AYA3二級結構與B細胞抗原表位。采用Chou-Fasman法和Garnier-Robson法預測Q8AYA3二級結構,各殘基Pα、Pβ、PT、PC 等參數意義參考文獻[5];用 Karplus-Schultz法預測分子骨架的柔韌性。用Kyte-Doolitle法根據序列的氨基酸組成預測Q8AYA3蛋白的疏水區(qū)和親水區(qū);用Emini法預測Q8AYA3蛋白的表面可及性(可能性);用Jameson-Wolf法預測Q8AYA3的抗原指數,分析Q8AYA3的B細胞抗原表位。

采用另一種蛋白質分析軟件antheprot進行驗證性預測。主要是預測Q8AYA3的親水性、疏水性及溶液可及性區(qū)段,采用Parker及Welling方法分別預測Q8AYA3的B細胞抗原表位,最后綜合DNAstar結果綜合分析Q8AYA3的B細胞抗原表位。

1.3 Q8AYA3的空間結構模建與空間表位預測 采用Swiss-model法[6]在線(http://swissmodel.expasy.org/)對五步蛇各種CLPs進行結構模建,采用automated mode方式進行空間結構預測。

采用在線軟件SEPPA[7](Spatial Epitope Prediction of Protein Antigens)(http://lifecenter.sgst.cn/seppa/)進行預測。SEPPA自動搜尋與Q8AYA3同源性最高的CLP晶體結構,并預測此晶體結構空間表位。

1.4 實驗驗證 將表位預測設計的結果送上海科肽生物技術公司合成,純度為95%以上。參照文獻[8]方法,用MBS(馬來酸酰亞胺苯甲酸-N羥基琥珀酸亞胺酯,Sigma公司)法將多肽與載體蛋白KLH(鑰孔藍蛋白,Sigma公司)進行偶聯(lián)。KLH-肽偶聯(lián)物與完全弗氏佐劑等體積混合,首次免疫新西蘭白兔。2周和4周后,KLH-肽聯(lián)合不完全弗氏佐劑進行第二次與第三次免疫。耳緣靜脈采血,得免疫血清,用瓊脂糖雙擴散法檢測多克隆抗體的生成情況。

2 結果

2.1 蛇毒C型凝集素序列比對 利用在線Align工具對五步蛇13條CLPs序列進行比對,結果如圖1。蛇毒CLPs通常由兩個同源性較高的分子量約為13～17 kD的亞基通過一對二硫鍵組成異二聚體,亞基的氨基酸長度為147-159,其中第1-23位為信號肽。各序列Cys位置比較保守,形成三對鏈內二硫鍵。以Q8AYA3為例,其二硫鍵主要是 Cys27-Cys38、Cys55-Cys145和Cys121-Cys137。CLP的兩個亞基通過一個亞基的Cys79與另一個亞基的Cys75形成鏈間二硫鍵。比對分析發(fā)現(xiàn),CLPs的N端結構域如α螺旋和β折疊以及中間的Loop同源性較高,主要起到了維持蛋白結構作用;而靠近C端的序列同源性較差,可能是CLPs多樣性和結合底物多樣性的原因。

2.2 二級結構及抗原表位預測 采用DNAstar protean模塊的Chou Fasman方案和Garnier Robson法進行二級結構分析,結果表明:Q8AYA3相對分子量為17 233.98,等電點是7.89,二級結構主要為4個α-螺旋和6個β-折疊,見圖2。

2.3 Q8AYA3親水性、可及性、可塑性及抗原性參數 Q8AYA3親水性、可及性、可塑性及抗原性預測結果見圖3。采用Kyte-Doolittle方法分析Q8AYA3的親水性,結果表明氨基酸區(qū)段 31-38、43-64、68-75、95-119、127-146為親水性高的區(qū)域。Emini法預測的表面可及性區(qū)段為 Lys43-Ala51、Glu57-Lys60、His68-Glu72、Asp99-Gly107、Thr126-Asp129。 根據 Karplus Schulz可塑性與Jameson-Wolf抗原指數預測結果,Q8AYA3的可塑性區(qū)與抗原表位區(qū)恰好對應,即19-25 、30-37 、43-64 、68-75 、96-113 、117-121 、122-132 、136-142。

2.4 Antheprot分析結果 采用Antheprot軟件分析了Q8AYA3的親水性、疏水性、抗原指數、溶劑可及性(即表面可及性)。結果見圖4,其中Lys43-Gly62區(qū)抗原指數(Parker et al)、親水性、溶液可及性指數均最高,其次為98NDCKREWSDGTKL110區(qū)。這兩個區(qū)段分別與DNAstar軟件預測的43-64區(qū)和95-119區(qū)完全吻合,多個預測方法共同表明這兩個區(qū)段具有良好的抗原表位特征。從13條CLPs序列對比結果可以發(fā)現(xiàn)43-64區(qū)保守性很高,并靠近N端(圖1),是一個較為理想的蛇毒CLPs“共同抗原”。而98～110區(qū)保守性略差,并位于多肽鏈中段,是抗原表位次要選擇。結合抗原設計原則,最終確定一個13肽的序列,即46KTW( A)DAEKFCTEQ58為最優(yōu)化的B細胞抗原表位區(qū)。由于CLPs的49位多數為A(Ala),所以序列設計為KTWADAEKFCTEQ。

2.5 Q8AYA3的結構預測與空間表位預測 輸入Q8AYA3氨基酸序列,在Swiss-model進行同源模建,數據庫自動匹配的結構模板為1c3aB,該蛋白是來源于黃斑原矛頭蝮(Protobothrops flavoviridis)的CLP蛋白flavocetin-Aβ亞基。Q8AYA3與 flavocetin-Aβ序列相似度為63%,圖5為預測的Q8AYA3空間結構,該結構中主要有2個α-螺旋和7個β-折疊組成,與DNAstar預測的二級結構結果稍有不同。實際上,CLP每個亞基中都含有3對非常保守的二硫鍵,導致CLPs的空間結構非常類似,也導致了蛋白質表面參數的相同。

圖1 13條五步蛇CLPs序列比對結果Fig.1 Alignment of the13 venom C typelectin sequences of five-pace snake

圖2 Dnastar軟件預測的Q8AYA3二級結構結果Fig.2 The secondary structure of Q8AYA3 protein predicted by Dnastar software

圖3 Q8AYA3親水性、可及性、可塑性及抗原性分析結果Fig.3 Hydrophilicity,surface probability,flexibility and antigenic index of Q8AYA3 predicted by Dnastar

圖4 Q8AYA3抗原性、親水性、可及性指數的Antheprot軟件分析結果Fig.4 Antigenicity,hydrophilicity and solvent accessibility of Q8AYA3 predicted by Antherprot software

圖5 同源模建得到的Q8AYA3空間結構Fig.5 Tertiary structure of Q8AYA3 predicted by swiss modeling

Q8AYA3空間抗原表位預測需要其晶體結構實驗數據。用SEPPA在線工具,對已知晶體結構的flavocetin-Aβ的空間表位進行了預測。結果見圖6(已經去除信號肽),黃色標記的氨基酸為空間抗原表位區(qū)。因為flavocetin-Aβ是Q8AYA3同源度最高的CLP蛋白,因此可以大致反映出Q8AYA3的空間抗原表位區(qū)。值得注意的是,flavocetin-Aβ中KFc-TQQHKG與前面預測的共同抗原“KTWADAEKFCTEQ”屬于同源性片段。這也說明該共同抗原肽是五步蛇CLP家族的理想抗原表位區(qū)。

圖6 SEPPA預測的flavocetin A空間表位結果(已去除信號肽)Fig.6 The predicted spatial epitope of flavocetin A by use of SEPPA,a computational server

圖7 瓊脂糖雙向擴散驗證免疫血Fig.7 Identification of the immune serum by quincuncial style agarose doubleimmuno-diffusion

2.6 實驗驗證 依照上述預測的“共同抗原”序列合成多肽,多肽與KLH偶聯(lián)后免疫新西蘭兔。第三次免疫之后10天采血,用0.8%瓊脂糖雙擴散法進行檢測抗體的生成情況,結果見圖7。中間孔為兔血清,1、2和3號孔分別為多肽、KLH蛋白和肽-KLH,4號和5號孔分別為五步蛇蛇毒和純化的蛇毒CLP。從結果看,1號多肽與血清沒有沉淀線,其他四個孔與血清孔均有明顯的沉淀線。結果說明:①多肽與血清沒有沉淀線,可能原因是多肽分子量太低而導致無沉淀。而血清與蛇毒粗毒及蛇毒C型凝集素均有沉淀,說明血清中確實含有針對此抗原表位肽的抗體;②血清中還存在抗載體蛋白KLH的抗體。

3 討論

從上世紀80年代Hopp和Woods提出親水性參數對抗原表位預測的方法以來[8],已有許多參數、算法發(fā)表,對B細胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推動作用。現(xiàn)在已經有許多關于蛋白質B細胞抗原表位肽預測的報道。一般來說,選擇蛋白質氨基酸序列的抗原表位,除了利用適當的蛋白質分析軟件,還需要綜合考慮選定片段的親水性、可塑性、轉角結構、電荷數等。序列以12-15個氨基酸為宜,序列應避免出現(xiàn)4個以上連續(xù)相鄰的疏水性殘基,序列中帶電荷的氨基酸越多越好[9,10]。Chou-Fasman/Garnier-Robson、Karplus-Schulz、Kyte-Doolittle、Emini 和Parker/Welling預測法為目前常用的二級結構、柔性、親水性、表面可及性及抗原性預測法。綜合分析這些度量值,可以大大提高預測的準確性。但值得注意的是,這種綜合分析是一種“全人工”的分析過程,缺乏客觀的標準,因此在預測的準確性上還難以令人滿意。無論是本論文中的軟件,還是在線程序如PEOPLE、BEPITOPE、Becepred等,都是將上述度量指標進行獨立地分析,缺乏數理數值上的運算和評分,人工評判會嚴重影響預測結果的特異性。隨著蛋白質結構數據庫及表位肽數據的不斷擴大,采用機器學習方法,Saha等[11]開發(fā)了基于神經網絡法的ABCpred軟件,通過Swiss-port和Bcipep數據庫提取的結構屬性作為訓練集,最終預測的準確性和特異性均大大提高。

本論文中,作者采用了2種分析軟件,并結合空間表位進行綜合預測,三方面結果有較好的一致性。但是,除了 46-58區(qū)外,還存在一段序列,即98NDCKREWSDGTKL110,也可能是理想的抗原表位區(qū)。該肽段位于轉角區(qū),具有較高的抗原指數、親水性和可塑性,更有意思的是該肽段與SEPPA預測的空間表位也具有同源區(qū)(SDGTK)(圖6,第二行突出顯示區(qū)),以上各參數表明98-110也是理想的抗原表位區(qū)。從二級結構特征看,該區(qū)域甚至比46-58區(qū)(螺旋區(qū))更好。但是從蛇毒CLPs家族同源性分析,該肽段的序列同源性比46-58區(qū)差。考慮到實驗最終目的是篩選蛇毒CLPs,因此優(yōu)先考慮CLP家族中同源性更高的片段作為“共同抗原”,即46-58區(qū),序列為KTWADAEKFCTEQ。由于蛇毒蛋白質結構數據較少,暫時沒有采用ABCpred法對結果進行驗證。

通過生物軟件對蛋白質抗原表位進行預測,將合成的抗原表位肽與載體蛋白偶聯(lián),免疫制備相應的抗體已有多篇成功的報道。例如Hui(1983)用纖維蛋白β鏈氨基端的七肽(Gly-His-Arg-Pro-Leu-Asp-Lys)通過MBS與KLH(鑰孔戚血藍蛋白)偶聯(lián)后,作為免疫原制備抗纖維蛋白單克隆抗體獲得成功[12];我國雒喜忠等對視黃酸誘導蛋白(RAI)進行了抗原表位預測,得出RAI的44-55區(qū)為抗原表位區(qū),合成相應肽段并與KLH偶聯(lián),制備得到了多克隆抗體[13];南文龍等[14]利用多種軟件和方法,綜合預測了H5N1亞型禽流感病毒血凝素Th和B細胞表位,取得了與實驗一致的結果。本論文中,我們已經將合成的KTWADAEKFCTEQ13肽與KLH交聯(lián),與佐劑聯(lián)合免疫得到了抗體血清。雖然血清與多肽沒有沉淀線,但蛇毒及蛇毒CLP與血清均有很明顯的沉淀,而且KLH-肽與血清的沉淀線要強于KLH與血清的沉淀線,說明免疫獲得了成功,也證明本文預測的結果的準確性,但特異性還有待于進一步實驗確定。

1 Huizinga EG,Tsuji S,Rornijn RA et al.Structureof glycoprotein Ibαand its complex with von willebrand factor A1 domain[J].Science,2002;297:1176-1179.

2 Li W F,Chen L,Li X M et al.A C-type lecin-like protein from Agkistrodon acutus venom binds to both platelet glycoprotein Ib and coagulation factor IX/factor X[J].Biochem Biophys Res Commun,2005;332(3):904-912.

3 Lu Q M,Navdaev A,Clemetson JM et al.Snakevenom C-typelectins interacting with platelet receptors,Structure-function relationshipsand effects on haemostasis[J].Toxin,2005;45(8):1089-1098.

4 Clemetson K J,Lu Q,Clemetson JM.Snake C-type lectin-like proteins and platelet receptors[J].Pathophysiol Haemost Thromb,2005;34(4-5):150-155.

5 萬 濤,孫 濤,吳加金.蛋白質順序性抗原決定簇的多參數綜合預測[J].中國免疫學雜志,1997;13(6):329-333.

6 Arnold K,Bordoli L,Kopp J et al.The SWISS-MODEL Workspace:A web-based environment for protein structurehomology modeling[J].Bioinformatics,2006;22:195-201.

7 Sun J,W u D,Xu T L et al.SEPPA:a computational server for spatial epitope prediction of protein antigens[J].Nucleic Acids Research,2009;37:612-616.

8 Hoop J P,Wood K R.Prediction of p rotein antigenic determinants from amino acid sequence[J].Proc Natl Acad Sci USA,1981;78(6):3824-3828.

9 黃艷新,鮑永利,李玉新.抗原表位預測的免疫信息學方法研究進展[J].中國免疫學雜志,2008;24(10):758-762.

10 Davydov Y I,Tonevitsky A G.Prediction of linear B-cell epitopes[J].Molecular Biology,2009;43(1):166-174.

11 Saha S,Bhasin M,Raghava GP S.Bcipep:A database of B-cell epitopes[J].BMCGenomics,2005;6(1):79-85.

12 Hui K Y,Haber E,Matsueda G R et al.Monoclonal antibodiesto a synthetic fibrin-like protein bind to human fibrin but not fibrinogen[J].Science,1983;222:1129-1131.

13 雒喜忠,王 閣,許 文 et al.RAI16蛋白合成肽多克隆抗體的制備及初步應用[J].細胞與分子免疫學雜志,2008;24(9):898-901.

14 南文龍,金寧一,魯會軍 et al.H5N1亞型禽流感病毒血凝素Th和B細胞表位預測及抗原分析[J].中國免疫學雜志,2009;25(8):630-637.