舒陰液洗劑微生物限度檢查方法學驗證

魏旭蘭 熊 青

舒陰液洗劑是本所臨床經(jīng)驗方，在臨床應(yīng)用已有30余年，專為治療各種病菌引起的外陰搔癢、外陰炎、外陰濕疹、陰道炎、尖銳濕疣而設(shè)，并能治療由各種真菌引起的皮膚病。為保證藥品質(zhì)量，按照中國藥典2005版[1]的要求，對其微生物限度檢查方法進行驗證，現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯增菌液（批號060622），營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號070110），玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號070315），膽鹽乳糖增菌液（批號060422），甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基060920），溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號060521），均購自中國生物制品檢定所。

1.2 菌種

大腸埃希菌[CMCCB44102]第2代，枯草芽孢桿菌[CMCCB63501]第2代，金黃色葡萄球菌[CMCCB26003]第2代，白色念珠菌[CMCCF98001]第2代，黑曲霉菌[CMCCF98003]第2代，將大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌分別接種肉湯營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)24h，白色念球菌接種于改良馬丁瓊脂斜面，培養(yǎng)48h，黑曲霉接種于改良馬丁瓊脂斜面，培養(yǎng)7d，分別用生理鹽水將其稀釋成 10-4～10-11，取菌落數(shù)在50～100cfu/mL范圍的菌稀釋液，作為陽性菌對照液。

1.3 稀釋液

pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.4 樣品

舒陰液洗劑（本所制劑室，批號20070319）。

2 方 法

2.1 直接接種法供試液制備

量取供試品10mL3份，加入pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，直接混勻，制成1∶10供試液，取2mL分別加入置2個平皿中。

2.2 直接接種法菌液制備

取1∶10供試液2mL，分別加入置2個平皿中，再分別加入大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌50～100個菌/mL的菌液1mL，作為加陽性菌供試液樣。每種菌制備2份。

2.3 培養(yǎng)基稀釋法供試液的制備

將1∶10供試品溶液1mL，分別注入10個平皿中，每個0.1mL，10個為一組，共兩組。

2.4 培養(yǎng)基稀釋法加陽性菌供試液的制備

將1∶10供試品溶液1mL，分別注入10個平皿中，每個0.1mL，10個為一組，再分別加入大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉50～100個菌/mL的菌液1mL，每種菌株兩組。

2.5 操作步驟

2.5.1 直接接種法

取1∶10供試液2mL注入2個平皿中，分別加入大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉50～100個菌/mL 的菌液1mL，作為加陽性菌供試液樣。每個菌制備2個平皿。

2.5.2 培養(yǎng)基稀釋法

將1∶10供試液2mL，分別注入20個平皿，再分別加入大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌50～100個菌/mL的菌液1mL，每組10個平皿，每個菌株兩組。分別加入已溶化保溫至45℃營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基15mL。每1mL供試品溶液所注的平皿中生長的菌落之和為1mL，計算每1mL供試品溶液的平均菌落數(shù)，按平皿法計數(shù)規(guī)則報告菌落數(shù)。

2.5.3 大腸埃希菌檢查

取1∶10供試品溶液10mL接種于膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，取上述培養(yǎng)物0.2mL，接種至含5mL MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24h在365nm紫外線觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)作本底對照。管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG印行。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試驗，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陰性。MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，為檢出大腸埃希菌；MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，為未檢出大腸埃希菌。另取50～100個菌/mL的大腸埃希菌液1mL按上述方法植被添加大腸埃希菌的供試品陽性對照管；取50～100個菌/mL的金黃色葡萄球菌1mL按上述方法制備添加金黃色球菌的供試品陰性對照管。

2.6 培養(yǎng)

各平皿培養(yǎng)基凝固后，細菌檢查平皿置30～35℃培養(yǎng)箱48h，霉菌檢查平皿置23～28℃培養(yǎng)箱72h。

2.7 樣品微生物限度測定

取供試品10mL，加pH=7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液90mL，混勻，分別按常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法各3份進行操作（表1～3）。

表1 直接接種法

表2 培養(yǎng)基稀釋法

表3 大腸埃希菌檢查結(jié)果

3 結(jié) 果

由表1～3的結(jié)果可見，舒陰液洗劑以常規(guī)方法檢查，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌、黑曲霉各菌的平均回收率分別為70.5%、20.3%、67.4%、89.4%、100%。該樣品對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的檢出均有影響，而對白色念球菌、黑曲霉的加樣回收率均高于70%，故認為常規(guī)法測定霉菌和酵母菌總數(shù)是符合中國藥典2005年版的要求的；采用培養(yǎng)基稀釋法金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌各菌的平均回收率分別為85.2%、100%、89.9%，均高于70%，故認為培養(yǎng)基稀釋法測定細菌總數(shù)是符合中國藥典2005版的要求的?？刂凭鷻z查舒陰液無明顯的影響，故控制菌采用常規(guī)法進行檢驗。

4 結(jié) 論

舒陰液洗劑可以使用常規(guī)法即直接接種法進行控制菌、霉菌及酵母菌總數(shù)檢查，以培養(yǎng)基稀釋法測定細菌總數(shù)檢查。

[1]中國藥典2005年版一部[S].2005.附錄70-73.