黃連湯有效部位對鴨疫里氏桿菌的抑菌率

紀麗莎，殷紅福，汪麗芬，張先福

（浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 臨安311300）

鴨疫里氏桿菌Riemerella anatipestifer病，也稱鴨傳染性漿膜炎，是鴨的一種細菌性傳染病，死亡率達30%～50%。該病以纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎、輸卵管炎、關節炎、腦膜炎等為主要病變特征［1－2］。鴨疫里氏桿菌具有21個血清型，各血清型相互之間沒有交叉免疫力，免疫預防效果不佳［3－5］；且鴨疫里氏桿菌對各類抗生素極易產生耐藥性［6－7］，在很多地區已經難以找到對鴨疫里氏桿菌敏感的藥物。鑒于此，我們前期試驗篩選出對鴨疫里氏桿菌病具有顯著效果并由黃連Coptis chinensis，黃柏Phellodendrion amurense和甘草Glycyrrhiza uralensis 3味中藥組成的中藥復方黃連湯［8］。經HPLC 測定，黃連湯有效成分分別為小檗堿 299.73 mg·kg－1，藥根堿 108.66 mg·kg－1，甘草酸 9.00 mg·kg－1，鹽酸小檗堿 5.7 g·kg－1，鹽酸巴馬汀 254.00 mg·kg－1（中草藥已錄用）。為了進一步研究黃連湯對鴨疫里氏桿菌中外膜蛋白的作用，本研究開展了黃連湯提取物對鴨疫里氏桿菌的抑菌率研究，為中藥抗菌機制的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥材 黃連、黃柏和甘草均購自浙江省臨安市中醫院。

1.1.2 菌株及試劑 鴨疫里氏桿菌，由浙江省農業科學院畜牧研究所提供，由筆者所在實驗室進行擴增培養。胰蛋白胨大豆肉湯培養基（TSB）［9］作為基礎培養基，配制固體培養基時，另按15 g·kg－1加瓊脂粉，制成胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）。

1.1.3 儀器與設備 UV-2450型精密紫外分光光度計（島津國際貿易有限公司），恒溫培養箱（杭州藍天化驗儀器廠），全自動高壓滅菌鍋（廣州東南科儀有限公司）

1.2 方法

1.2.1 中藥原料處理 采用水提醇沉法：取黃連2 g，黃柏2 g，甘草4 g放入燒杯中，加適量的水，浸泡，煮沸后用小火持續20～30 min（視藥物而定）；濾出煎液，濾渣加水，進行第2次煎煮（20～30 min）；濾出煎液，合并2次濾液，用紗布過濾，得濾液75.0 mL，加入體積分數為95%乙醇225 mL，4℃下靜置24 h，濾紙過濾除沉淀，在75℃下減壓回收乙醇，85℃下繼續濃縮得原藥34.8 mL，藥液含生藥229.9 g·L－1，微孔濾膜過濾除菌后，放置在－20℃冰箱保存備用。

1.2.2 鴨疫里氏桿菌的復蘇和菌懸液的制備［10］在TSB肉湯培養基中加入15 g·kg－1瓊脂，加熱溶解，121℃高壓滅菌20 min，傾倒在平板培養皿內，以此用作凍干菌株的復蘇平板培養基。利用平板劃線法將凍干菌株接種至平板內，37℃，培養24 h后，挑取單個生長的菌落，轉種至TSB肉湯培養基，振蕩培養12 h。此為菌懸液。

1.2.3 擴增培養 取培養12 h的菌懸液100 μL，加至裝有TSB的肉湯培養基中，37℃恒溫箱，分別培養0，2，4，6，8和10 h，對各個時間段的生長菌落進行計數，并測定吸光度值。

1.2.4 菌落計數和吸光度值的相關性分析 采用平板菌落計數法［11］。將定時培養的菌液進行10－1，10－2，10－3，…，10－7，10倍遞增稀釋，然后分別取不同稀釋度的菌液100 μL滴加于胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）平板上，用無菌涂棒涂布均勻，每個稀釋度重復3塊平板，37℃溫箱中培養12 h。統計平板上生長的活菌數，乘以稀釋倍數，再乘以10，即為菌濃度（×1010個·L－1）。定時吸取適量菌液和參比液，將參比液調0后，測定菌懸液的吸光度DO600。該試驗設3次重復。

1.2.5 藥物稀釋與菌液接種 取無菌試管，將黃連湯原液與培養基按照1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7的體積比稀釋，藥物質量濃度分別為115.0，77.0，57.0，46.0，38.0，33.0和29.0 g·L－1，分別放置到各個試管中。接種菌懸液20，50，120，190和250 μL到各組配制好的試管藥液中。置于37℃，180 r·min－1的恒溫搖床中培養12 h。該試驗設3次重復。另取1支含菌懸液的試管作對照，此為凈生長量。

1.2.6 抑制生長率的計算 將不同藥物的光密度值代入到鴨疫里氏桿菌生長曲線的線性關系方程式中，計算抑制生長率。抑制生長率=（細菌凈生長量－處理凈生長量）/細菌凈生長量×100%。

1.3 數據分析

試驗結果用Excel處理，用SPSS 11.0統計軟件對試驗數據進行ANOVA分析和回歸分析［12］。

2 結果與分析

2.1 鴨疫里氏桿菌濃度標準曲線

細菌在培養了0，2，4，6，8和10 h后，取3.0 mL細菌懸液與參比液，進行吸光度DO600測定，以吸光度為橫坐標，以菌濃度為縱坐標（ × 1010個·L－1），繪制標準曲線［13］（圖1）。

曲線方程為y=0.485 1e1.9068x，R2=0.981 1。將其化為線性模型后進行顯著性檢驗，得F=156.006＞F0.01（1，3） =34.1，說明在 0.01 水平上兩者相關性顯著，線性關系良好。

圖1 鴨疫里氏桿菌的吸光度和菌濃度的標準曲線Figure 1 Curve between OD values and the concentration of Riemerella anatipestifer

2.2 不同質量濃度中藥浸提物對不同菌量的抑制效果

通過肉眼觀察，菌量為20 μL時藥物質量濃度在33.0 g·L－1時液體出現混濁，38.0 g·L－1時有絮狀物；菌量在50和120 μL時，藥物質量濃度大于38.0 g·L－1時液體較清澈，但46.0 g·L－1有絮狀物；菌量在190和250 μL時，藥物質量濃度在38.0 g·L－1時，液體出現混濁，在57.0和46.0 g·L－1都有絮狀沉淀，但57.0 g·L－1透明度大于46.0 g·L－1。從結果可以看出，黃連湯有抑菌效果，但其抑制效果不能得出確切數值。現通過定量的方法來測定抑制率。紫外分光光度計測定各菌量的吸光度值見表1。

表1 不同藥物質量濃度下對應的吸光度Table 1 OD values of various drug concentrations corresponding

從表1中可以看出，除第7組外，隨著藥物質量濃度的增大，吸光度依次遞減，抑制率依次增大，但第7組的吸光度值小于第6組。將以上吸光度值數據代入到曲線方程中，得到各吸光度對應的菌濃度（表2）。

由表2說明，藥物質量濃度在29.0 g·L－1時，95%的菌已經被抑制。菌濃度小于0.7×1010個·L－1時，液體已經處于澄清透明。橫向對比，除第1組和第2組外，第3組到第7組隨著菌量的增加，菌濃度依次增大。將以上菌濃度通過抑菌生長率公式求得各質量濃度對應的抑菌率（表3）。

通過上表可見，通過縱向對比，菌量在20和50 μL時，藥物質量濃度的顯著性差異出現在第3組，菌量在120，190和250 μL時，藥物質量濃度的顯著性差異出現在第4組，與肉眼觀察不相吻合。各個菌量的抑菌率分別為99.99%，99.98%，99.99%，99.98%和99.98%，抑菌率都在99.98%以上。

表2 藥物質量濃度作用下對應的菌濃度Table 2 Bacterial content of under the action of various drug concentrations

表3 黃連湯有效部位抑菌率Table 3 Antibacterial rate of ethanol extracts of Coptidis rhizoma Decoction against Riemerella anatipestifer

3 討論

從表1中可以看出，除第7組外，其余藥物質量濃度組隨著藥物質量濃度的增大，吸光度值依次遞減，抑制率依次增大，但第7組的吸光度值小于第6組。藥物質量濃度在77.0 g·L－1時抑菌效果最佳。試驗說明，藥物質量濃度越大抑制細菌的效率反而會減弱，可能因為中藥是由多種復雜成分構成，不是所有成分都直接作用于致病菌達到抑制細菌的目的，有些成分會因為藥物質量濃度的增高起到自身抑制的效果，故中藥的抑制率反而會減少，甚至有些中藥的抗菌有效成分在體外抑菌試驗中測不出或顯示不強，但在體內卻有較好的抑菌效果（如魚腥草Houttuynia cordata）［14］。前期試驗已經證明，鴨疫里氏桿菌對人工發病鴨具有顯著的治療效果。

通過肉眼觀察，菌量為20，50，120，190和250 μL時，對應的含有絮狀物的藥物質量濃度分別為38.0，46.0，46.0，57.0和57.0 g·L－1。由表2的數值可以看出，絮狀物都出現在0.5×1010～0.6×1010個·L－1，是抑制與非抑制的臨界值，可能是細菌在生長時與藥物對抗直至被殺死后所產生細菌死亡之后的菌體變為絮狀物，而大于臨界值的細菌未被抑制住，會使菌液混濁；小于臨界值的細菌被藥物抑制，使液體澄清透明。死亡之后的菌體給實驗人員的判讀帶來了不便的影響，測定細菌吸光度值，具有定量準確、方法簡便及重復性好等優點。

通過表2可以看出，在20 μL菌量時，第1組的菌濃度為227×1010個·L－1，遠遠低于對照組5 017×1010個·L－1，抑制率為95.00%。同樣，在第2組里，只有24×1010個·L－1個細菌。這可能是因為藥物作用后，細菌崩解，破裂，胞質流出，體積變小，減少了混濁度，從而減少了吸光度。這說明藥量在很少的情況下，都有很大的抑制效果。下一步做藥物對細菌外膜蛋白的提取時，選藥物質量濃度為 29.0 g·L－1的即可。

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