燙傷寧的無菌檢查方法驗證

黃 蓓

（廣西中醫學院附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011）

2005年版《中國藥典（一部）》規定，在進行藥品無菌檢查時應驗證所用方法，以確認所采用的方法適合于該藥品的無菌檢查[1]。燙傷寧是由地榆、虎杖、紅花、陳皮、當歸、冰片等組成的中藥復方制劑，以食用植物油為基質，具有抗菌、消炎作用，對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等多種細菌均有抑制作用，主治燙傷、燒傷。根據藥典要求，對該藥應進行無菌檢查，但因其具有抗菌作用，不能用直接接種法，且本制劑為油劑，不易大量過濾。為此，筆者參照2005年版《中國藥典（一部）》微生物限度檢查項下非水溶性供試品的離心沉淀集菌法[1]，采用離心與薄膜過濾相結合的方法對燙傷寧進行無菌檢查，并對所用方法進行驗證。

1 實驗材料

HTY-Ⅲ型智能集菌儀（杭州泰林醫療器械廠）；LXJ-Ⅱ離心沉淀機（上海醫用分析儀器廠）；全封閉無菌試驗過濾培養器（杭州高得醫療器械有限公司）。硫乙醇酸鹽流體培養基（批號為080616）、改良馬丁培養基（批號為071018）、營養肉湯培養基（批號為071013）、營養瓊脂培養基（批號為080321），均由廣西藥品檢驗所提供；稀釋液為0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液（自配）。金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均由廣西藥品檢驗所提供。供試品燙傷寧（自制）。

2 方法與結果

2.1 無菌檢查方法驗證[2-3]

2.1.1 菌液制備

取30～35℃下培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌與枯草芽孢桿菌的營養肉湯培養物1 mL，加到9 mL的0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋成含菌數小于100 CFU/mL的菌懸液；取23～28℃下培養24～48 h的白色念珠菌的改良馬丁液體培養物1 mL，加到9 mL的0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋成含菌數小于100 CFU/mL的菌懸液；取30～35℃下培養18～24 h的生孢梭菌的硫乙醇酸鹽液體培養物1 mL，加到9 mL的0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋成含菌數小于100 CFU/mL的菌懸液；取23～28℃下培養1周的黑曲霉菌的改良馬丁瓊脂斜面培養物，加0.9%氯化鈉溶液3 mL，洗下孢子，轉移至另一空管，用0.9%氯化鈉溶液10倍稀釋成含孢子數小于100 CFU/mL的菌懸液。

2.1.2 活菌計數

活菌計數結果見表1。

表1 活菌計數結果（CFU/mL）

2.1.3 取樣與前處理方法驗證

取6瓶燙傷寧，每瓶各加入1種菌懸液2 mL后，分別轉移至6個100 mL無菌刻度離心管中，以3000 r/min的轉速離心處理20 min，分離上清液，每管留底部液體2 mL。每管取上清液及底部液體各2 mL，分別等量注入2個平皿中，立即傾注營養瓊脂培養基，混勻，凝固后倒置培養，計數，并計算細菌離心收集率。細菌離心收集率（%）=底部液體細菌培養每平皿平均菌落數/1 mL菌懸液平均菌落數×100%。結果由表2可見，離心集菌方法有效、可行。

表2 上清液及底部液體細菌培養結果

2.1.4 取樣量與前處理

參照2005年版《中國藥典（一部）》中無菌檢查的有關規定，做驗證試驗時，每一驗證菌株需要的樣品量相當于每一濾筒的樣品量，即包裝規格為100 mL的燙傷寧每一驗證菌株需要3瓶。取燙傷寧3瓶，分別轉移至6個50 mL無菌刻度離心管中，以3000 r/min轉速離心處理20 min，棄去上清液，每管留底部液體2 mL，每管加2 mL已滅菌的聚山梨酯-80，振搖使混勻[1]，然后將混合液體匯集至450 mL的0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，45℃水浴中適當加熱，振搖得供試液。

2.1.5 方法驗證試驗

取KSF 220型全封閉無菌試驗過濾培養器（兩聯）1套，將2.1.3項下供試品趁熱按薄膜過濾法過濾至一管，過濾完畢后用0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液[4]100 mL沖洗濾器；并在沖洗液中加入小于100 CFU的試驗菌，再泵入相應的培養基作為供試品管；另一管不過濾供試品（其他操作同上），作為陽性對照管；取全封閉無菌試驗過濾培養器，每個濾器內過濾2 mL已滅菌的聚山梨酯-80和0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，再取硫乙醇酸鹽培養基及改良馬丁培養基，分別泵入兩管集菌器中，作為陰性對照管；最后取試驗用的硫乙醇酸鹽培養基及改良馬丁培養基作為空白對照管。將上述集菌器培養5 d，每天觀察并記錄結果（表3）。結果表明，供試品管與金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌對照管相比24 h內生長良好，與白色念珠菌、黑曲霉菌對照管相比48 h內生長良好，硫乙醇酸鹽培養基陰性對照管、改良馬丁培養基陰性對照管及空白對照管5 d內無菌生長，說明樣品經上述處理后無抑菌作用，所用的聚山梨酯-80與0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液對試驗菌的生長無影響，此無菌檢查方法可行。

表3 方法驗證試驗結果

2.2 燙傷寧無菌檢查法

取燙傷寧9瓶，每瓶轉移到2個50 mL無菌刻度離心管中，以3000 r/min轉速離心處理20 min，棄去上清液，每管留底部液體2 mL，每管加2 mL已滅菌的聚山梨酯-80，充分振搖后分別匯集至450 mL的0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，45℃水浴加熱，振搖。將樣品趁熱分別按薄膜過濾法過濾至KSF 330型全封閉無菌試驗過濾培養器（三聯）中，濾后用300 mL的0.1%聚山梨酯-80-氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾器，沖洗完畢后于兩管泵入硫乙醇酸鹽培養基（其中一管接入小于100 CFU的金黃色葡萄球菌作為陽性對照管[1]），另一管泵入改良馬丁培養基100 mL。陰性對照管的制備同2.1.5項下的陰性對照。上述各管在規定溫度下培養14 d，逐日觀察。結果供試品管、陰性對照管均澄清，陽性管生長良好，判供試品符合規定。

3 討論

根據2005年版《中國藥典（一部）》附錄ⅩⅢ無菌檢查法要求，陽性對照應根據供試品特性選擇陽性對照菌，無抑菌作用及抗細菌的供試品，可以金黃色葡萄球菌為對照菌。燙傷寧為抗細菌制劑，故選擇金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，且方法驗證試驗結果證明，金黃色葡萄球菌管24 h內生長良好，為敏感菌種。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出版社，2005：附錄 71.

[2]中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范[M].北京：中國醫藥科技出版社，2005：313-323.

[3]馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京：科學出版社，2000：18-21.

[4]胡文紅，國 明.復方磺胺嘧啶鋅乳膏無菌檢查法的研究[J].中國藥事，2006，20（3）：154.