兩種不同規格心寧片微生物限度檢查方法的驗證

由亞寧，姜 華 ，李惠娥

（1.陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061； 2.山東省淄博市藥品檢驗所，山東 淄博 255000）

心寧片有0.3 g/片與0.63 g/片兩種不同規格，但組方和制法相同，均由丹參、槐花、川芎、三七、紅花、降香、赤芍等中藥組成，具有活血化瘀、理氣止痛的功效，臨床上主要用于冠心病、心絞痛等心血管疾病的治療[1]。為了更有效地控制藥品質量，筆者通過采用多種方法消除藥物的抑菌活性，并對其微生物污染進行檢測，建立了藥品的微生物限度檢查方法。現報道如下。

1 實驗材料

生化培養箱。供試品心寧片Ⅰ（規格為每片0.3 g，批號分別為20080201，20070804，20080502），心寧片"（規格為每片 0.63 g，批號分別為20070114，20070116，20070118）均由陜西君碧莎制藥有限公司生產。培養基有改良馬丁培養基、營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養基、膽鹽乳糖發酵培養基、曙紅亞甲藍瓊脂培養基（EMB）、膽鹽乳糖增菌培養基、4-甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）培養基，蛋白胨，0.9%氯化鈉溶液，pH為7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液（稀釋液），均采用高壓蒸氣滅菌法進行滅菌[2]。試驗用菌種包括金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌 [CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]和黑曲霉[CMCC（F）98003]，均來自中國醫學細菌保藏中心。

2 方法與結果

2.1 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證

2.1.1 試驗菌株菌液制備

取經35℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與枯草芽孢桿菌肉湯液體培養物1 mL，加入9 mL的0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋制成50～100 CFU/mL的菌懸液，做活菌計數備用。取經25℃培養24～48 h的白色念珠菌改良馬丁液體培養物1 mL，加入9 mL的0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋制成50～100 CFU/mL的菌懸液，做活菌計數備用。取經25℃培養1周的黑曲霉斜面培養物，加0.9%氯化鈉溶液3～5 mL，洗下孢子，轉移至另一空管，標準比濁管比濁后，取1 mL，加入9 mL的0.9%氯化鈉溶液中，10倍稀釋制成50～100 CFU/mL的孢子菌懸液，做活菌計數備用。

2.1.2 供試液制備

取樣品10 g，加pH為7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，制成濃度為1∶10的供試液。

2.1.3 方法驗證

常規法：取1∶10的供試液1 mL，分別加入5種代表試驗菌株50～100 CFU/mL，立即傾注15～20 mL瓊脂培養基中，平行制備2個平皿，待凝固后置規定的溫度培養24～72 h觀察結果，計算菌落數，作為試驗組；同法測定相應加入的試驗菌數作為菌液組，測定供試品本底菌數作為供試品對照組。試驗組菌回收率（%）=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100%，據此計算回收率。結果見表1。

表1 常規法驗證回收率試驗結果（%，n=3）

培養基稀釋法：采用加0.5 mL/皿，0.2 mL/皿供試液，分別加入不同的試驗菌株50～100 CFU，照2.1.3常規法試驗進行。結果見表2。

表2 培養基稀釋法驗證回收率試驗結果（%，n=3）

2.2 控制菌檢查方法驗證

取兩種規格樣品制備的1∶10供試液各10 mL和大腸埃希菌試驗菌液1 mL，加入到膽鹽乳糖增菌培養基100 mL中，依法進行大腸埃希菌檢查；取兩種規格樣品制備的1∶10供試液各1 mL和大腸埃希菌試驗菌液1 mL，加入到膽鹽乳糖發酵培養基10 mL中，依法進行大腸菌群檢查[2]。結果見表3。大腸埃希菌和大腸菌群的檢查均以金黃色葡萄球菌為陰性對照菌（陰性菌對照組），方法同試驗組操作，兩種規格的心寧片檢查方法一致。結果見表3。

表3 控制菌方法驗證試驗結果

2.3 線性關系考察

分別取兩種規格的心寧片制備的供試液（0.1 g/mL）1.0，0.5，0.2 mL/皿，按細菌培養條件進行培養，以取樣量（X）為橫坐標、回收率（Y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程分別為 Y=-111.63 X+118.09（ r=1.00），Y=-108.52 X+117.99（ r=1.00）。結果表明，取樣量與回收率呈良好的線性關系。結果見表4。

表4 線性關系考察結果

3 討論

從表1可以看出，對于組方和制法相同而規格不同的供試品，采用常規法對5株試驗菌進行驗證試驗，結果表明該藥物對細菌有抑制作用，常規法不能用于其細菌檢查；而對白色念珠菌、黑曲霉的回收率均高于70%，無抑制作用，表明常規法可用于其霉菌和酵母菌檢查。表2結果表明，采用培養基稀釋法（每皿0.5 mL）時，0.3 g與0.63 g的心寧片的金黃色葡萄球菌回收率分別為59.5%與65.8%，大腸埃希菌回收率分別為92.1%與92.5%。為了消除心寧片對細菌的抑菌作用，采用培養基稀釋法（每皿0.2 mL），0.3 g與0.63 g的心寧片金黃色葡萄球菌回收率分別為97.9%與95.0%，表明該方法能消除藥物對試驗菌的抑制作用，3種試驗的回收率均達到70%以上。說明心寧片對革蘭陰性和陽性菌均具有很強的抑制作用，可采用培養基稀釋法（每皿0.2 mL）進行細菌數測定。表3結果顯示，兩種不同規格的心寧片控制菌大腸埃希菌、大腸菌群檢查采用常規法，結果檢出了大腸埃希菌，說明該法可用于控制菌大腸埃希菌、大腸菌群的檢查。

線性關系考察結果表明，兩種不同規格的心寧片微生物限度檢查方法無明顯差異，且對金黃色葡萄球菌的抑菌性也無明顯差異。

兩種不同規格（0.3 g和0.63 g）的心寧片微生物限度檢查均可采用培養基稀釋法（每皿0.2 mL）進行細菌數測定，采用常規法測定霉菌和酵母菌數，并可采用常規法進行控制菌大腸埃希菌、大腸菌群的檢查，且方法準確可靠、重現性好。

[1]劉正剛，蔡光先，劉柏炎.心寧片治療冠心病心絞痛30例總結[J].湖南中醫雜志，2007，23（2）：1-2.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：化學工業出版社，2005：附錄 93.