產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a的生長代謝特性

劉 楓，李建政，昌 盛，陳忠林

(哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，哈爾濱 150090，blist@126.com)

產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a的生長代謝特性

劉 楓，李建政，昌 盛，陳忠林

(哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，哈爾濱 150090，blist@126.com)

為了對產氫產乙酸互營共培養體的擴大培養和應用奠定基礎，采用靜態培養實驗，考察了碳源、氮源、溫度和pH等因素對前期分離得到的新型共培養體7-m-2a的生長代謝特性的影響.結果表明，產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a對丙酸、丁酸和苯甲酸都具有很高的轉化率，其最適宜碳源為丁酸，不易利用葡萄糖和蔗糖;以蛋白胨和酵母粉混合物為氮源時，其生長代謝活動最旺盛，適宜的pH和溫度分別為8.0和45℃.

厭氧消化;產氫產乙酸菌;互營共培養體;生理生態特性

在參與厭氧消化的各微生物類群中，產氫產乙酸菌群在營養生態位上位于產酸發酵菌群和產甲烷菌群之間，能將產酸發酵菌群代謝產生的丙酸、丁酸等揮發性有機酸(VFAs)和乙醇等進一步降解轉化為乙酸和CO2/H2，為后續的產甲烷菌群提供了可以直接利用的底物［1－4］.研究表明，產氫產乙酸菌群的生態位比產甲烷菌群的更加狹窄，生長和代謝速度更慢、而且生長條件更加苛刻，對厭氧消化進程具有顯著的限制作用.同時，在一定的負荷范圍內，產甲烷菌群的生物量和代謝強度是受產氫產乙酸菌群代謝產物的控制.因此，提高產氫產乙酸互營共培養體的功能作用，將會有效提高厭氧生物處理系統的處理效能和運行穩定性［5］.然而，目前所報道的產氫產乙酸菌株很少，對其生理生態習性的了解也不夠深入和廣泛［ 4，6－9］.本文將對前期研究中分離篩選出的產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a進行研究，以考察其在不同碳源、氮源和pH及溫度等條件下的生理生態學特性，以期為在厭氧生物處理系統中富集更多的產氫產乙酸菌和工程應用提供指導.

1 材料與方法

1.1 菌種來源與培養基

產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a是課題組前期以厭氧活性污泥為出發菌群選育得到的，利用PCR-DGGE技術對其菌群結構進行解析，結果顯示此共培養體中含有專性的互營產乙酸菌Desulfotomaculum sp.Iso－W2及其伴生菌，其中的伴生菌是能利用甲酸鹽和H2/CO2的Uncultured bacterium 054E12－B－DI－P58和Sedimentibacter sp.JN18－A14－H［10］.實驗采用的基本培養基參考文獻［10］.在進行不同碳源(有機物)轉化試驗時，在培養基基本成分的基礎上，分別加入丙酸鈉、丁酸鈉、苯甲酸、葡萄糖、蔗糖，加入量均為10.0 g.在進行不同氮源對7-m-2a生長和產氫產乙酸能力影響試驗時，以丁酸鈉培養基為基礎，更換不同氮源，1 L培養基的加入量為3.0 g，其他成分同基本培養基.

1.2 靜態實驗方法

向50 mL血清瓶中注入30 mL培養基，充氮脫氧，滅菌;從厭氧固體培養基上挑取少量的7-m-2a菌落配制成菌懸液，通過血球計數板計數為1.3×108個/mL.用1 mL無菌注射器接種，接種量為1 mL.接種后置于空氣浴中在35℃和110 r/min下培養，5 d后，取樣分析氣體成分、揮發酸和細胞生長等指標.實驗分4組，分別考察碳源、氮源、pH及溫度對7-m-2a生長和產氫產乙酸代謝的影響，每組實驗設置3個平行樣，相關檢測數據取平均值.

1.3 分析方法

發酵氣體積采用玻璃注射器計量，其組分采用氣相色譜儀(SP－6801T，山東魯南瑞虹化工儀器有限公司)分析［11］.液相末端發酵產物(VFAs和乙醇)的分析，采用另一臺氣相色譜儀(SP－ 6890，山東魯南瑞虹化工儀器有限公司)測定［11］.菌懸液細胞密度的測定采用分光光度法［11］.pH的值測定采用PHS－25型酸度計測，苯甲酸含量測定采用紫外分光光度法［11］.

2 結果與討論

2.1 碳源對7-m-2a生長和產氫產乙酸代謝的影響

實驗結果(表1)顯示，碳源的選擇對互營共培養體7-m-2a生長的影響較大.以丁酸為底物時，7-m-2a生長最旺盛，培養結束時，其吸光度(OD)和乙酸產量分別高達0.51 mg/L和1 644 mg/L.適宜的碳源其次是苯甲酸和丙酸，培養結束時，其OD和乙酸質量濃度分別為0. 26，0. 20，1 383，1 063 mg/L.而以葡萄糖、蔗糖為底物時，7-m-2a只呈現微弱生長，說明在7-m-2a中，優勢菌株不易利用葡萄糖或蔗糖.從7-m-2a產氫能力分析，以丁酸為碳源時，其氫氣產量最高，為217 mL/L-培養基;其次是苯甲酸和丙酸，其氫氣產量分別可達157 mL/L-培養基和155 mL/L-培養基;在葡萄糖或蔗糖培養基中，7-m-2a的產氫產乙酸性能最差.以上現象表明，丁酸是最為合適的碳源，在之后的其他因素試驗時，選擇丁酸作為碳源物質.

表1 碳源對產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a的影響

2.2 氮源對7-m-2a生長和產氫產乙酸代謝的影響

氮源的性質對不同微生物的增殖和代謝會產生不同的影響［12］.本實驗設計的氮源含量是3 g/L，如果采用2種氮源物質，則每一種氮源物質1.5 g/L;如果采用3種氮源物質，則每一種氮源物質各為1 g/L.共6組實驗:蛋白胨(P)、牛肉膏(B)、酵母粉(Y)、P+B、P+Y、P+B+Y(表2).

表2 氮源對產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a的影響

實驗結果(表2)顯示，以蛋白胨和牛肉膏組合為氮源時，7-m-2a生長最旺盛，培養結束時，其OD值達到1.35.適宜7-m-2a生長的氮源其次是蛋白胨和酵母粉組合，培養結束時的OD值為1.01.而單獨以酵母粉作為氮源時，7-m-2a生長最弱，培養結束時的OD值僅達到0.34.從7-m-2a產氫產乙酸效能分析，以蛋白胨和酵母粉為氮源時，其乙酸產量和氫氣產量分別高達1 510 mg/L和138 mL/L-培養基.其次是單獨以酵母粉作為氮源時，其乙酸產量和氫氣產量分別為1 337 mg/L和118 mL/L-培養基.利用蛋白胨和牛肉膏組合時，產氫產乙酸效能最差，但當在此組合基礎上添加了酵母粉后，其乙酸和氫氣產量稍有上漲，分別達到了1 154 mg/L和113 mL/L-培養基.以上現象表明，酵母粉最適宜7-m-2a發揮產氫、產乙酸性能，蛋白胨最適宜7-m-2a的生長繁殖;在兩者形成的組合試驗中，其無論是對7-m-2a生長繁殖的促進，還是對產氫產乙酸效能的發揮，都是綜合效果最佳的.

2.3 pH值對7-m-2a生長和產氫產乙酸代謝的影響

如表3所示，當pH值為8時，7-m-2a的生長最旺盛、產氫產乙酸效能最高.培養結束時，其OD值達到1. 15，產乙酸量和產氫量也分別達到1 369 mg/L和131 mL/L-培養基.

表3 pH對產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a的影響

2.4 溫度對7-m-2a生長和產氫產乙酸效能的影響

如表4所示，隨著溫度的改變，7-m-2a的生長波動幅度較大.在溫度為30℃時，其生長量達到第一個峰值，培養結束時的OD值為1. 07，產乙酸量和產氫量也達到最大，分別為1 527 mg/L和180 mL/L-培養基;隨著溫度的上升，7-m-2a的生長和代謝效能都有所減弱;當溫度上升到45℃時，7-m-2a的生長量達到第二個峰值，培養結束時其OD值達到0. 99，產乙酸量和產氫量也分別達到1 675 mg/L和177 mL/L-培養基;之后隨著溫度的繼續上升，7-m-2a的生長代謝活動幾乎停止.以上現象表明，7-m-2a在30℃和45℃下均能很好的進行生長代謝活動.由此推測，產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a中可能存在著嗜中溫和中度嗜高溫兩類細菌.由于高溫條件下，菌體的代謝速率一般都比較快，所以選擇45℃為產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a的最佳培養溫度.

表4 溫度對產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a的影響

3 結論

1)產氫產乙酸互營共培養體7-m-2a對于丙酸、丁酸和苯甲酸都有很高的產氫產乙酸代謝能力，其最適宜碳源為丁酸，但不易利用葡萄糖和蔗糖.

2)以胰蛋白胨和酵母膏混合物為氮源時，互營共培養體7-m-2a的生長代謝活性最高，適宜的培養溫度為45℃，pH為8.0.

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Physioecologic and metabolic products characteristics of a new isolated syntrophic acetogenesis coculture 7-m-2a

LIU Feng，LI Jian-zheng，CHANG Sheng，CHEN Zhong-lin

(State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China，blist@126.com)

In order to culture the syntrophic acetogenesis coculture in large scale and make it be used in fullscale application，the effect of carbon source，nitrogen source，temperature and pH on the activity of a new isolated syntrophic acetogenesis cocluture 7-m-2a was investigated in this study.The result of batch cultivation experiments shows that the syntrophic acetogenesis coculture 7-m-2a can utilize propionate，butyrate and benzoate as carbon source，and the most appropriate substrate is butyrate，while it almost can not degrade glucose and sucrose.The metabolic activity is the most active when using the mixture of tryptone and yeast as nitrogen source.The suitable cultivation temperature and pH are 45℃and 8.0.

anaerobic digestion;syntrophic acetogenic bacteria;syntrophic cocluture;physioecologic characteristics

X703

A

0367－6234(2010)06－0890－03

2010－03－01.

哈爾濱市科技創新人才研究專項資金項目(2009RFXXS004).

劉 楓(1984—)女，博士研究生;

李建政(1965—)男，教授，博士生導師.

(編輯 趙麗瑩)