抗肌萎縮蛋白在不同類型肌營養不良癥中表達的研究

王偉文,廖曉陽,吳渝憲,王慶松

Duchenne型肌營養不良癥 (Duchenne muscular dystrophy,DMD)和Becker型肌營養不良癥 (Becker muscular dystrophy,BMD)是男性最常見的 X連鎖隱性遺傳病。目前已經確認 DMD的致病基因位于 X染色體短臂 XP21上,并編碼 427 k D的抗肌萎縮蛋白 (dystrophin,Dys)。Dys分布于骨骼肌細胞膜的質膜面,起細胞支架作用,Dys表達障礙可導致肌纖維膜的不穩定及肌纖維細胞壞死,最終導致DMD或 BMD不同的臨床表型[1]。盡管Dys在 DMD/BMD患者肌細胞中的表達缺乏已經明確,但其表達形式與臨床表型的關系以及在其他類型肌營養不良癥患者肌組織中的表達情況國內還少有報道。現應用免疫組化技術對我科近 10年來所搜集的 DMD、BMD、肢帶型肌營養不良(limb-girdle muscular dystrophy,LGMD)、面肩肱型肌營養不良 (facioscapulohumeral muscular dystrophy,FSHD)和神經性肌萎縮患者的肌組織進行 Dys檢測,并結合其不同的臨床表型從蛋白分子機制上加以探討,為肌營養不良癥的診斷、分型及預后判定提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 DMD患者 71例,BMD患者17例,均為漢族男性。患者均符合DMD/BMD臨床診斷標準,并按運動功能障礙分級 (由輕到重分Ⅰ ～Ⅹ級)。另外搜集 LGMD患者 8例,FSHD患者 4例,神經源性肌萎縮患者 11例,所有患者來源于我院神經內科門診。對照組為無神經肌肉疾病的急診創傷患者。

1.2 組織病理標本制備 選擇患者輕、中度受累的肌肉組織,在局麻無菌情況下行肌肉組織活檢術,將修剪后的組織塊放入液氮冷卻的異戊烷中快速冷凍,并置于液氮中保存。

1.3 免疫組化染色 冷凍切片厚約 4 μm,抗 Dys特異性抗體 Anti5-7由第四軍醫大學分子生物技術中心惠贈,使用效價為 1∶2 500,鏈菌素親生物素 -過氧化物酶免疫組化試劑盒購置 Maxim Biotech公司。組化程序參照試劑盒說明進行。DAB-H2O2顯色,并用蘇木素復染胞核,設立陰性空白對照和正常人組織標本陽性對照。

1.4 統計學方法 計量資料的組間比較采用 t檢驗,P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Dys在 DMD/BMD患者肌肉組織中的表達 免疫組化染色結果顯示,Dys在正常對照的肌肉組織中呈陽性表達,且沿肌細胞膜分布 (見圖 1a)。71例臨床表型為 DMD的患者中,有63例肌細胞中未檢測到 Dys陽性表達,細胞膜邊界不可見,細胞核排列紊亂 (見圖 1b);有 8例肌細胞膜上檢測到 Dys呈弱陽性表達,陽性表達率為 11%,可見 Dys呈不連續的斑片狀,沿肌細胞膜分布。17例臨床表型為 BMD的患者肌細胞膜上可染出不連續的斑片狀,Dys呈弱陽性表達 (見圖1c)。

2.2 肌肉組織中有無 Dys表達的 DMD患者的運動功能障礙分級情況及年齡和病程比較 肌肉組織中無 Dys陽性表達的DMD患者,其運動功能障礙分級≥Ⅲ級,而肌肉組織中 Dys呈陽性表達的 DMD患者,其運動功能障礙分級為Ⅱ級。肌肉組織中有無 Dys表達的 DMD患者的年齡、病程間差別均無統計學意義 (P＞0.05,見表 1)。

2.3 Dys在其他肌營養不良癥患者肌肉組織中的表達 8例 LGMD,4例 FSHD,11例神經源性肌萎縮患者的肌肉組織中均檢測到 Dys陽性表達,并且完整的勾畫出肌細胞膜的邊界,但肌纖維橫徑明顯縮小并粗細不一 (見圖1d)。

表 1 肌肉組織中有無Dys表達的 DMD患者的運動功能障礙分級情況及年齡和病程的比較Table 1 The relation between dystrophin in muscle and dyskinesia grade from DMD or BMD

圖 1 a.Dys在正常人肌細胞膜上呈陽性表達 (SP法 ×400);b.Dys在 DMD患者肌肉組織中呈陰性表達,細胞膜邊界不可見,細胞核排列紊亂 (SP法 ×400);c.Dys在 BMD患者肌肉細胞膜上呈斑片狀、不連續的弱陽性表達 (SP法 ×400);d.Dys在神經源性肌萎縮患者的肌細胞膜上呈陽性表達,肌纖維橫徑粗細不一 (SP法 ×100)Figure 1 a.Positive dystrophin immunostaining was localized to the sarcolemma from the nomal individusls(SP×400);b.No detectable dystrophin in muscle of DMD(SP×400);c.Thin dystrophin immunostaining from BMD consisted of a patchy or discontinuous staining pattern aroud most fibers(SP×400);d.Positive dystrophin immunostaining was detected in sarcolemma from the muscle of neurologic dystriophy,and fiber diameter wasvariable(SP×100)

3 討論

Dys是 DMD基因的表達產物,含3 685個氨基酸,分子量約 427 kD,主要分布于肌細胞的質膜面,是橫紋肌細胞膜骨架蛋白的重要組成部分,其在保護肌細胞結構完整、維持肌細胞正常收縮功能中起重要作用。該蛋白分為 4個結構區域:N端區、棒狀區、半胱氨酸富集區和C端區[1]。

Anti5-7多克隆抗體是針對 Dys棒狀區 15-18重復區域的抗體。以往的研究表明,該抗體能特異地檢測到正常人肌細胞膜上的 Dys表達[2]。本研究結果提示,71例臨床表型為 DMD的患者中,63例患者肌細胞上未檢測到 Dys的表達,8例患者的肌細胞膜上可檢測到斑片狀、不連續的 Dys弱陽性表達,陽性表達率為 11%。再將這 8例患者的運動功能障礙分級、年齡、病程與上述 63例 DMD患者相比較,結果發現在他們年齡、病程均較接近的情況下,Dys呈弱陽性表達的患者,其運動功能障礙分級較 Dys陰性表達的患者低,亦即 Dys弱陽性表達患者的癥狀較陰性表達患者的癥狀輕。多數臨床表型為 DMD的患者其肌細胞膜上缺乏 Dys的表達,這與我們以往的研究結果相一致。而就另外8例臨床表型考慮 DMD的患者而言,可能因 DMD基因突變造成外顯子以外區域的移碼,仍部分維持了開放閱讀框架的完整性,而產生一個具有部分功能、短小的小分子蛋白,對肌細胞的結構和功能的維持起到一定的作用,而表現為一個較輕的臨床表型。當然,這 8例患者是否是BMD有待于我們今后進一步的臨床隨訪。

與 DMD相比,BMD有著較輕的臨床表型及較低的發病率。17例臨床表型為BMD的患者其肌肉組織中均檢測到 Dys弱陽性表達,且呈斑片狀沿肌細胞膜分布。根據開放閱讀框架學說,當基因突變時,若鄰近外顯子仍能維持開放閱讀框架不變,則產生一個尚有部分功能的 Dys,由于該蛋白的結構和功能不同于正常的Dys,致使肌細胞膜的通透性、穩定性發生了改變,而表現為一個較 DMD輕的臨床表型[3-4]。結合上述 8例存在少量 Dys表達的患者的臨床運動功能障礙分級,可以推斷 Dys是否表達及其質或量的改變是我們推斷肌營養不良癥臨床表型及判定臨床預后的重要依據。

進行性肌營養不良癥除了 DMD、BMD外,還包括先天性肌營養不良、強直性肌營養不良、FSHD及 LGMD等。本研究對 8例 LGMD,4例 FSHD患者的肌肉組織 Dys檢測的結果顯示,患者肌細胞膜上均檢測到 Dys陽性表達。該結果也預示著這兩類肌營養不良癥的病理機制與Dys表達無關。另外,本研究對 11例神經源性肌萎縮患者肌肉組織 Dys檢測結果顯示,該類患者均存在著 Dys陽性表達,勾畫出的肌細胞膜邊界提示肌纖維橫徑明顯縮小并粗細不一。

總之,DMD/BMD的臨床表型與肌細胞膜上 Dys表達的缺乏密切相關,Dys表達的質或量的改變是鑒別其臨床表型及判斷臨床預后的重要依據。免疫組化檢測骨骼肌肉組織 Dys的方法可用于復雜性DMD/BMD與不典型 FSHD、LGMD、神經源性肌萎縮等疾病的鑒別。

1 Deconinck N,Dan B.Pathophysiology of duchenne muscular dystrophy:current hypotheses[J].Pediatr Neurol,2007,36(1):1-7.

2 van Essen AJ,Kneppers ALJ,van der Hout AH,et al.The clinical and molecular genetic approach to Duchenne and Becker muscular dystrophy:an updated protocal[J].J Med Genet,2007,34:805-812.

3 Arahata K,Hoffman EP,Kunkel LM,et al.Dystrophin diagnosis:comparison of dystriohin abnormalities by immunofluorescence and immunoblot analyses[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,86:7154-7158.

4 Wells DJ.Sarcolemmal ion channels in dystrophin-deficient skeletal muscle fibres[J].J Muscle Res Cell Motil,2006,27(5-7):387-98.